Субклітинна локалізація адаптерного білка Ruk, у клітинах НЕК293

Abstract

Субклітинну локалізацію адаптерного білка Ruk1 досліджували в клітинах ембріональної нирки людини лінії НЕК293, трансфікованих вектором pRc/CMV2/Ruk1-Glu-tag. Імунофлуоресцентним аналізом показано, що рекомбінантний білок дифузно розподілений в цитоплазмі і ядрі транс­фікованих клітин НЕК293 з формуванням чітких пунктатів, локалізованих в ядрі, які, наймовірніше, відповідають ядерцям. Ядерна локалізація Ruk1 підтверджена імуноблотингом екст­рактів ізольованих ядер трансфікованих клітин НЕК293 з використанням моноклональних анти-Glu-tag антитіл, а також нетрансфікованих клітин HЕK293 і клітин U937 з використан­ням поліклональних анти-Ruk антитіл, Імунодот-блот аналізом виявлено здатність афінно очищеного препарату Ruk1 Glu-tagged взаємодіяти з ДНК тимусу теляти, але не з ДНК Escherichia coli Ядерна локалізація Ruk1 дозволяє передбачити виконання адаптерним білком нових, поки що не з'ясованих функцій, в ядрі еукаріотичної клітини.

Субклеточную локализацию адаптерного белка Rukt исследова­ли в клетках эмбриональной почки человека линии НЕК293, трансфиццроеанных вектором pRc/CMV2/Ruk1Glu-tag. Иммунофлуоресцентным анализом показано, что рекомбинантный белок диффузно распределен в цитоплазме и ядре трансфицированных клеток НЕК293 с формированием четких пунктатов, локализованных в ядре, наиболее вероятно соответ­ствующих ядрышкам. Ядерная локализация Ruk1 подтверждена иммуноблотингом экстрактов изолированных ядер трансфицированных клеток НЕК293 с использованием моноклональных анти-Glu-tag антител, а также нетрансфицированных клеток НЕК293 и клеток U937 с использованием поликлональных анти-Ruk антител. Иммунодот-блот анализом выявлена способность аффинно очищенного препарата Ruk1Glu-tagged взаимодействовать с ДНК тимуса теленка, но не с ДНК Escherichia coli. Ядерная локализация Ruk1 позволяет предполо­жить выполнение адаптерным белком новых, пока еще не выясненных, функций в ядре эукариотической клетки.

Subcellular localization of adapter protein Ruk1 has been investigated in human embryonic kidney HEK293 cells transfected with pRc/CMV2/Ruk1-Glu-tag. Using immunofluorescence microscopy, it was shown that the recombinant protein was distributed diffusely in both cytoplasm and nucleus, but with punctated structures in the nucleus, which correspond in all probability to the nucleolus. The Ruk1 localization in the nucleus was confirmed by Western blotting of nucleic extracts prepared from transfected HEK293 cells using monoclonal anti-Glu-tag antibodies, as well as from nontransfected HEK293 and U937 cells using polyclonal anti-Ruk antibodies. The ability of affine purified Ruk1 Glu-tagged preparation to bind to DNA from calf thymus, but not to Escherichia coli DNA, was revealed by the immunodot-blot analysis. The nuclear localization of Ruk1 suggests that this adapter protein is involved in some new, yet unrecognized functions, in the eukaryotic cell nucleus.