Interaction between adaptor proteins Ruk/CIN85 and Tks4 in normal and tumor cells of different tissue origins

Abstract

Aim. To study the interaction of adaptor protein Ruk/CIN85 SH3 domains with endogenous adaptor protein Tks4 in normal and tumor cells of different tissue origins. Methods. GST in vitro pull-down assay was performed using total cell lysates of cell lines of different origins. Results. Using GST in vitro pull-down assay, we have determined that SH3A domain of adaptor protein Ruk/CIN85 precipitated full-length form of adaptor protein Tks4 (Mr 120 kDa) from lysates of human breast (MCF-7, MDA-MB-231), melanoma (MM-4), colon (HT-29, DLD-1) tumor cells as well as from lysates of mouse Lewis lung carcinoma cells (LLC) and fibroblasts (NIH 3T3). It has been also revealed that all Ruk/CIN85 SH3 domains (A, B and C) with high efficiency precipitate the additional forms of Tks4 with Mr 75, 90 and 160 kDa from lysates of human colon carcinoma cells and mouse fibroblasts. The molecular nature of new multiple forms of Tks4 has not been determined to date. Conclusions. New multiple molecular forms of adaptor protein Tks4 with Mr 75, 90 and 160 kDa, able to interact with high affinity with SH3 domains of Ruk/CIN85, were identified using GST in vitro pull-down assay. The data obtained suggest that interaction between Ruk/CIN85 SH3 domains with Tks4 endogenous forms is determined by cellular context while a level of this interaction can be regulated in the course of physiological cellular responses.

Мета. З’ясувати особливості взаємодії окремих доменів SH3 адаптерного білка Ruk/CIN85 з ендогенним адаптерним білком Tks4 у нормальних і пухлинних клітинах різного тканинного походження. Методи. Аналіз GST in vitro pull-down проводили з використанням загальних клітинних лізатів ліній клітин різного тканинного походження. Результати. Встановлено, що домен SH3А адаптерного білка Ruk/CIN85 преципітує повнорозмірну форму адаптерного білка Tks4 (Mr 120 кДа) з лізатів пухлинних клітин молочної залози (MCF-7, MDA-MB-231), меланоми (MM-4), ободової кишки (HT-29, DLD-1) людини, а також карциноми легені Льюїс (LLC) та фібробластів (NIH 3T3) миші. Виявлено також, що всі домени SH3 білка Ruk/CIN85 (А, В і С) з високою ефективністю преципітують додаткові форми Tks4 з Mr 75, 90 і 160 кДа з лізатів клітин карциноми ободової кишки людини та фібробластів миші. Молекулярну природу нових множинних форм Tks4 на сьогодні не встановлено. Висновки. Ідентифіковано нові множинні молекулярні форми адаптерного білка Tks4 з Mr 75, 90 і 160 кДа, здатні з високою афінністю взаємодіяти з доменами SH3 білка Ruk/CIN85. Отримані дані дозволяють припустити, що можливість зв’язування доменів SH3 Ruk/CIN85 з ендогенними формами білка Tks4 обумовлена клітинним контекстом, тоді як рівень взаємодії регулюється в процесі реалізації фізіологічних відповідей клітин.

Цель. Выяснить особенности взаимодействия отдельных доменов SH3 адаптерного белка Ruk/CIN85 с эндогенным адаптерным белком Tks4 в нормальных и опухолевых клетках разного тканевого происхождения. Методы. Анализ GST in vitro pull-down проводили с использованием общих клеточных лизатов линий клеток разного тканевого происхождения. Результаты. Установлено, что домен SH3А адаптерного белка Ruk/CIN85 преципитирует полноразмерную форму адаптерного белка Tks4 (Mr 120 кДа) из лизатов опухолевых клеток молочной железы (MCF-7, MDAMB-231), меланомы (MM-4), ободочной кишки (HT-29, DLD-1) человека, а также карциномы легкого Льюис (LLC) и фибробластов (NIH 3T3) мыши. Выявлено также, что все домены SH3 белка Ruk/CIN85 (А, В и С) с высокой эффективностью преципитируют дополнительные формы Tks4 с Mr 75, 90 и 160 кДа из лизатов клеток карциномы ободочной кишки человека и фибробластов мыши. Молекулярная природа новых множественных форм Tks4 на сегодня не установлена. Выводы. При помощи анализа GST in vitro pull-down идентифицированы новые множественные молекулярные формы адаптерного белка Tks4 с Mr 75–90 и 160 кДа, способные с высокой аффинностью взаимодействовать с доменами SH3 белка Ruk/CIN85. Полученные данные позволяют предположить, что возможность взаимодействия доменов SH3 белка Ruk/CIN85 с эндогенными формами белка Tks4 определяется клеточным контекстом, в то время как уровень связывания регулируется в процессе реализации физиологических ответов клеток.