Динамика расщепления протеазой полиэдров полиэдрина вируса ядерного полиэдроза тутового шелкопряда (Bombyx mori) и идентификация расщепляемых связей

Abstract

В процессе растворения полиэдров вируса ядерного полиэдроза (ВЯЛ) В. mori при рН 11,0 и комнатной температуре за 2 ч протеаза полиэдров расщепляет в полипептидной цепи полиэдрина (244 остатка аминокислот) пептидные связи Tyr-Ile (208–209), Tyr-Thr (186–187), Ala-Asn (121–122) и Trp-Ser (88–89). Ни одна связь не расщепляется окончательно (100 %), по данным электрофореза в полиакриламдином геле (ПААГ) с добавлением додецилсульфата натрия, что приводит к появлению набора перекрывающихся полипептидных цепей с м. м. 28000 (целая полипептидная цепь), 25000, 22000, 14500, 10500 и 8000 (ее фрагменты). Этим фрагментам полипептидной цепи отвечают (по данным первичной структуры) такие фрагменты: 1–208 (м. м. по первичной структуре 24715), 1–186 (21980), 1–121 (14362), 1–88 (10443) и 122–186 (7633). Первой при 15-мин растворении расщепляется связь 208–209, за ней (45 мин) – связь 186–187 и две последние расщепляются за 2 ч. При увеличении времени растворения результаты не изменяются. Но при 2-ч растворении при 37 °С дополнительно расщепляются связи Tyr-Ixu (118–119), Phe-Val (193–194) и Tyr-Lys (203–204), причем связи 203–204, 208–209, 88–89 и 118–119 расщепляются полностью, а остальные – частично. Это приводит, к появлению целого набора фрагментов: 118–186, 122–186, 118–193, 122–193, 118–203, 122–203, 1–88 с м. м., вычисленными на основе первичной структуры, 7633, 7916, 8445, 8728, 9765, 10048, 10443 соответственно, что коррелирует с диффузной полосой с м. м. 7000–10000 в ПААГ. Дискутиру­ ется влияние протеазы полиэдров на такие процессы, как диссоциация–ассоциация полиэдрина в растворах и ассоциация фрагментов полиэдрина с мембранами вирионов.

It is shown that polyhedral protease (PP) cleaves the polyhedrin polypeptide chain bonds Tyr–Ile (208–209), Tyr–Thr (186–187), Ala–Asn (121–122), Trp–Ser (88–89) upon polyhedron dissolution under alkaline (pH 11.0) conditions at room temperature during 2 hours. According to the data obtained by the sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), none of the bonds is cleaved completely, that results in the formation of overlapping polypeptides with molecular weights of 28000 (a whole polypeptide chain), 25000, 22000, 14500, 10500, 8000 (polypeptide chain fragments). We calculated the molecular weights of all possible fragments which could be derived from the polyhedrin polypeptide chain (28 kDa) by PP cleavage. The 25, 22, 14.5, 10.5, and 88 kDa polypeptides correspond to the polypeptide chain fragments 1–208 (m. w. 24715), 1–186 (m. w. 21980), 1–121 (14362), 1–88 (10443), 122–186 (7633). The bond 208–209 is the first to show the cleavage in 15 min of dissolution, the bond 186–187 is the second (in 45 min), and the bonds 121–122, 88–89 are cleaved in 120 min. These results do not depend on the prolongation of the dissolution time at room temperture, while the bonds Tyr-Leu (118–119), Phe-Val (193–194) and Tyr-Lys (203–204) are cleaved in addition after 120 min of dissolution at 37 °C. Under these conditions the bonds 88–89, 118–119, 203–204, 208–209 are cleaved completely contrary to the bonds 121–122, 186–187, 193–194 cleaved only partially. A series of fragments 1–88, 118/122–186/193/203 with the calculated molecular weights of 7633, 7916, 8445, 8728, 9765, 10048, 10443 respectively is released by the PP cleavage at 37 °C. These data are in accord with a diffused band in the range of molecular weights of 7000–10000, obtained by SDS-PAGE for the PP cleaved polyhedrin at 37 °C. The PP cleavage effect on the association/dissociation process of polyhedrin in solution as well as on the association of polyhedrin and its fragments with virion membranes is discussed considering the data obtained.

У процесі розчинення поліедрів вірусу ядерного поліедрозу (ВЯП) В. mori при рН 11 С і кімнатній температурі за 2 год протеаза поліедрів розщеплює в поліпептидному ланцюгу полі­ едрину (244 залишки амінокислот) пептидні зв'язки Tyr-lle (208–209), Tyr-Thr (186—187), Ala-Asn (121–122) та Trp-Ser (88–89). Жоден зв'язок не розщеплюється остаточно (100 %), згідно з даними електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ) з додаванням додецилсульфату натрію, що при­ зводить до появи набору поліпептидних ланцюгів, які перекри­ваються, з м. м. 28000 (цілий поліпептидний ланцюг), 25000, 22000, 14500, 10500 та 8000 (його фрагменти). Цим фрагмен­там поліпептид ного ланцюга відповідають (за даними первин­ної структури) такі фрагменти: 1–208 (м. м. за первинною структурою 24715), 1–186 (21980), 1–121 (14362), 1–88 (10443) і 122–186 (7633). Першим при 15-хв розчиненні розщеплюється зв'язок 208–209, за ним (45 хв) – зв'язок 186–187 і два останніх розщеплюються за 2 год. Із збіль­шенням часу розчинення результати не змінюються. Але при 2-год розчиненні за температури 37 °С додатково розщеплю­ються зв'язки Tyr-Leu (118–119), Phe-Val (193–194) та Tyr-Lys (203-204), причому зв'язки 203–204, 208–209, 88–89 та 118–119 розщеплюються повністю, а решта – частково. Це спричинює появу цілого набору фрагментів: 118–186, 122–186, 118–193, 122–193, 118–203, 122–203, 1–88 з м. м. 7633, 7916, 8445, 8728, 9765, 10048, 10443 відповідно, вирахуваними на основі первинної структури, що корелює з дифузною смугою з м. м. 7000–10000 в ПААГ. Дискутується вплив протеази поліедрів на такі процеси, як дисоціація– асоціація поліедрину в розчинах та асоціація фрагментів поліедрину з мембранами віріонів.