Цель. Создание биоаффинного сорбента на основе ориентированно иммобилизованного белка А Staphylococcus aureus (SPA) через два целлюлозосвязывающих домена (СBD) Clostridium thermocellum и его применение для очистки антител. Методы. С использованием последовательностей ДНК, кодирующих SPA и два СBD, сконструирован ген слитного белка SPA-CBD2 и обеспечено его получение в растворимой форме экспрессией в клетках Escherichia coli. Целевой белок иммобилизовали методом биоаффинного связывния на микрокристаллической целлюлозе. Результаты. Установлены такие характеристики биоаффинного сорбента, как емкость (1 мг SPA-CBD2 /1 мл целлюлози), динамическая емкость (3 мг иммуноглобулинов мыши/1 мл сорбента) и продуктивность, а также показана его стабильность при долгосрочном хранении. С помощью биоаффинного сорбента выделены фракции иммуноглобулинов с чистотой более 95 %. Определено, что очищенные таким способом антитела с высокой чувствительностью выявляют соответствующие антигены. Выводы. Предложенный биоаффинный сорбент позволяет получать очищенные функционально активные полии моноклональные антитела, а также проводить фракционирование на подклассы иммуноглобулинов G мыши.
Ключевые слова: антитела, белок А, целлюлозосвязывающий домен, иммобилизация белка, аффинная хроматография.
Мета. Створення біоафінного сорбента на основі орієнтовано іммобілізованого білка А Staphylococcus aureus (SPA) через два целюлозозв’язувальних домени (СBD) Clostridium thermocellum та його застосування для очищення антитіл. Методи. З використанням послідовностей ДНК, кодуючих SPA і два СBD, сконструйовано ген злитого білка SPA-CBD2 та забезпечено його отримання в розчинній формі експресією у клітинах Escherichia coli. Цільовий білок іммобілізовано методом біоафінного зв’язування на мікрокристалічній целюлозі. Результати. Встановлено такі характеристики біоафінного сорбента, як ємність (1 мг SPACBD2/1 мл целюлози), динамічна ємність (3 мг імуноглобулінів миші/1 мл сорбента) і продуктивність, а також показано його стабільність при тривалому зберіганні. За допомогою біоафінного сорбента виділено фракції імуноглобулінів з чистотою понад 95 %. Визначено, що очищені у такий спосіб антитіла з високою чутливістю виявляють відповідні антигени. Висновки. Запропонований біоафінний сорбент дозволяє отримувати очищені функціонально активні поліі моноклональні анттіла, а також проводити фракціонування на підкласи імуноглобулінів G миші.
Ключові слова: антитіла, білок А, целюлозозв’язувальний домен, іммобілізація білка, афінна хроматографія.
Aim. The obtaining of bioaffinity sorbent based on the immobilized protein A of S. aureus (SPA) using two cellulose-binding domains (CBD), and its application for purification of antibodies. Methods. The DNA sequences encoding SPA and two CBD were genetically fused, expressed in the high-productive Escherichia coli system and the protein SPA-CBD2 was obtained in a soluble form. The SPA-CBD2 fusion protein was affinity immobilized on the microcrystalline cellulose. Results. Capacity of bioaffinity sorbent (1 mg SPA-CBD2/1 ml CC31-cellulose), dynamic capacity (3 mg mouse IgG/1 ml bioaffinity sorbent), efficiency and stability during prolonged storage were determined. The bioffinity sorbent was used for purification of antibodies. The purity of antibodies in eluted fractions was more than 95 %. The purified antibodies detected target antigens with a high sensitivity. Conclusions. The designed bioaffinity sorbent provides obtaining pure poly- and monoclonal antibodies in functionally active form and can be useful for the fractionation of mouse immunoglobulin G.
Keywords: antibodies, protein A, cellulose-binding domain, protein immobilization, affinity chromatography.
