Подбор оптимальных условий проведения цепной реакции синтеза ДНК при идентификации мутаций в 12-м экзоне гена фенилаланингидроксилазы человека

Abstract

Описаны условия проведения реакции амплификации ДНК для определения мутаций в 12-м экзоне гена фенилаланингидроксилазы (ФАГид). Указано на необходимость оптимизации условий реакции. Подчеркивается последовательность составления реакционной смеси, при этом праймеры, фермент и трифосфаты следует добавлять после денатурации ДНК. ДНК можно выделять не только из цельной крови больных фенилкетонурией (ФКУ), но и из сухих пятен крови на фильтровальной бумаге. В результате амплификации образуется фрагмент гена ФАГид длиной 245 пар оснований (п. о.), несущий мутации. Последующая дот-гибридизация с мутантними мечеными зондами позволяет определить гетерозиготное носительство у здоровых членов семей.

Описано умови проведення реакції ампліфікації ДНК для визначення мутацій у 12-му екзоні гена фенілаланінгідроксилази (ФАГід). Вказано на необхідність оптимізації умов реакції. Підкреслюється важливість послідовності складання реакційній суміші, при цьому праймери, фермент і трифосфати слід додавати після денатурації ДНК. ДНК можна виділяти не тільки з цільної крові хворих на фенілкетонурію (ФКУ), а й із сухих плям крові на фільтрувальному папері. В результаті ампліфікації утворюється фрагмент гена ФАГід довжиною 245 пар основ, що несе мутації. Подальша дот-гібридизація з мутантними міченими зондами дозволяє визначити гетерозиготне носійство у здорових членів сімей.

The conditions of the amplification procedure for region of gene of human phenylalanine hydroxylase with some PKU mutations were elaborated. Genomic DNA of PKU-palients was isolated from whole blood and from dry blood spots on filter paper. The concentration of EDTA must be low to prevent inhibition of the reaction. It is necessary to perform dot-hybridization of amplificational sample with mutant DNA-probes for identification of mutations and rapid carrier testing.