Вплив мутацій серину 275 з ''лівого плавника'' Р2Х3 рецептора на показники активації каналу та десенситизацію

Abstract

Р2Х3 рецептори експресуються в сенсорних нейронах i вiдповiдають за генерацiю больових сигналiв пiсля активацiї їх АТФ. Вони є перспективними мiшенями для анальгетичних лiкiв, проте до сьогоднi достеменно не вiдома точна структура для сайта зв’язування АТФ. Цей фактор сповiльнює розробку нових специфiчних лiкiв. За допомогою гомологiчної моделi Р2Х3 рецептора було iдентифiковано амiнокислоту серин 275 з дiлянки так званого “лiвого плавника”, яка розташована бiля iмовiрного сайта зв’язування АТФ i може служити потенцiальним кандидатом, що фiксує агонiст у сайтi зв’язування та впливає на кiнетичнi параметри каналу. Для перевiрки даної гiпотези було сконструйовано декiлька мутантних рецепторiв, де серин 275 було замiнено на амiнокислоти з рiзними гiдропатичними властивостями, а саме S275A, S275V та S275C. За допомогою методики петч клемпу протестовано рiзнi мутанти i виконано порiвняння їх функцiональних властивостей з гiдропатичним iндексом для серину, ала- нiну, валiну, цистеїну. Показано, що серин 275 впливає на процеси десенситизацiї рецептора, ресенситизацiю, ефективнiсть зв’язування агонiстiв та амплiтуду струмiв, що вони генерують. Висловлено припущення, що в дикому типi рецептора серин 275 формує “кришку” для сайта зв’язування шляхом формування водневих зв’язкiв з агонiстом. Таким чином агонiст утримується в сайтi зв’язування, запобiгаючи його швидкiй дисоцiацiї. Зроблено висновок, що серин 275, вiрогiдно, напряму контактує з агонiстом, стимулюючи активацiю рецептора та десенситизацiю.

Р2Х3 рецепторы экспрессируются в сенсорных нейронах и отвечают за генерацию болевых сигналов после активации их АТФ. Они являются перспективными мишенями для анальгетических лекарств, однако до сих пор точно не известна точная структура для сайта связывания АТФ. Этот фактор замедляет разработку новых специфических лекарств. С помощью гомологической модели Р2Х3 рецептора была идентифицирована аминокислота серин 275 с участка так называемого “левого плавника”, расположенная возле предполагаемого сайта связывания АТФ и которая может служить потенциальным кандидатом, фиксирующим агонист в сайте связывания и влияющим на кинетические параметры канала. Для проверки данной гипотезы было сконструировано несколько мутантных рецепторов, где серин 275 был заменен на аминокислоты с разными гидропатическими свойствами, а именно S275A, S275V и S275C. С помощью методики пэтч клэмп протестированы различные мутанты и проведено сравнение их функциональных свойств с гидропатическим индексом для серина, аланина, валина, цистеина. Показано, что серин 275 влияет на процессы десенситизации рецептора, ресенситизацию, эффективность связывания агонистов и амплитуду токов, которые они генерируют. Высказано предположение, что в диком типе рецептора серин 275 формирует “крышку” для сайта связывания путем формирования водородных связей с агонистом. Таким образом агонист удерживается в сайте связывания, что предотвращает его быструю диссоциацию. Сделан взвод, что серин 275, вероятно, напрямую контактирует с агонистом, стимулируя активацию рецептора и десенситизацию.

P2X3 receptors expressed in sensory neurons are responsible for generation of pain signals after activation by extracellular ATP. P2X3 receptor is a prospective target for analgesic drugs, however, the structure of ATP binding site is not known in such details which can help to design new specific ligands. Using the homology model of P2X3 receptor, we identified serine 275 from the region of socelled “left flipper”, which is located near the hypothetical ATP binding site as a potential candidate for the capture of the agonist in the binding pocket and affects channel kinetic characteristics. To explore this hypothesis, we generated several mutants where serine 275 was substituted with aminoacids with variable hydrophobic properties: S275A, S275V and S275C. Using patch clamp technique we tested these mutants and compared their functional properties with the hydropathy indices for serine, alanine, valine, cysteine. It is shown that serine 275 takes part in the processes of receptor desensitization and resensitization and influences the efficiency of agonist binding and the generated current amplitude. We suggest that serine 275 in the WT P2X3 receptor shapes a cap for the binding pocket, by forming H-bonds with the agonist and, in such way, capturing agonist in the binding site, preventing its fast dissociation. Taken together, our results suggest that serine 275 probably directly interacts with the agonist to promote receptor activation and desensitization.