Вивчення поліморфізму довжини інтронів генів α-тубуліну як метод аналізу генетичної диференціації рослин

Abstract

Розроблено та впроваджено новий вид ДНК-маркерів, які ґрунтуються на аналізі поліморфізму І інтрону генів α-тубуліну. Здійснено біоінформаційний пошук генів α-тубуліну Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum. Показано, що більшість генів α-тубуліну містили по 4–5 екзонів та 3–4 інтрони. Виявлено декілька винятків, зокрема ген α-тубуліну A. thaliana TUBA6 містить лише 2 екзони та 1 інтрон, а ген TUBA4 – 3 екзони та 2 інтрони. Встановлено, що довжини інтронів значною мірою відрізняються, навіть у межах одного виду. Також виявлено певну системність у кількості пар нуклеотидів екзонів. На основі даних аналізу екзон-інтронної структури генів α-тубуліну розроблено пару універсальних вироджених праймерів та проведено оцінку поліморфізму довжини І інтрону генів α-тубуліну в Arabidopsis thaliana та різних сортів L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum та S. lycopersicum. Показано утворення видоспецифічних ДНК-профілів, які містили різну кількість ампліконів І інтрону генів α-тубуліну. Діапазон варіювання розмірів ампліконів фрагментів інтронів, наприклад у S. tuberoum, становив 150–2 000 п. н. Природа появи великих фрагментів ДНК (понад 1 500 п. н.) у електрофоретичних спектрах проаналізованих видів потребує додаткових досліджень, оскільки такі фрагменти в цілому не передбачені результатами біоінформаційного аналізу. Виявлено поліморфізм довжини окремих фрагментів інтронів α-тубуліну серед сортів L. usitatissimum, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum, що дозволило диференціювати їх між собою. Отримані результати підтверджують доцільність подальшого використання поліморфізму довжин І інтрону генів α-тубуліну для генотипування та оцінки генетичної різноманітності різних видів та сортів вищих рослин. Розроблена ДНК-маркерна система є універсальною й поєднує в собі надійність, швидкість отримання вихідних даних і простоту їхнього аналізу.

Разработан и внедрен новый вид ДНК-маркеров, которые оценивают полиморфизм I интрона генов α-тубулина. Выполнен биоинформационный поиск генов α-тубулина у Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solanum tuberosum и Solanum lycopersicum. Показано, что большинство генов α-тубулина содержат по 4–5 экзонов и 3–4 интрона. Было выявлено несколько исключений. Например, ген α-тубулина A. thaliana TUBA6 содержит только 2 экзона и 1 интрон, а ген TUBA4 – 3 экзона и 2 интрона. Установлено, что длина интронов значительно варьирует даже внутри одного вида. Учитывая данные анализа экзон-интронной структуры генов α-тубулина, была разработана пара универсальных вырожденных праймеров и проведена оценка полиморфизма длины I интрона генов α-тубулина у A. thaliana и различных сортов L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum, S. lycopersicum. Показано наличие видоспецифических ДНК-профилей, содержащих разное количество ампликонов I интрона генов α-тубулина. Диапазон варьирования размеров ампликонов фрагментов интронов например, S. tuberosum, составлял 150–2 000 п. н. Причина появления больших фрагментов ДНК (свыше 1 500 п. н.) в електрофоретических спектрах проанализированных видов требует дополнительных исследований, поскольку такие фрагменты в целом не предусмотрены результатами биоинформационного анализа. Выявлен полиморфизм длин отдельных фрагментов интронов генов α-тубулина, что позволило дифференцировать различные сорта L. usitatissimum, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum между собой. Полученные результаты подтверждают целесообразность дальнейшего использования оценки полиморфизма длин I интрона генов α-тубулина в качестве универсальной ДНК-маркерной системы для проведения генотипирования и оценки генетического разнообразия различных видов (сортов) высших растений.

A new type of DNA markers based on the analysis of the α-tubulin 1st intron polymorphism has been developed and implemented. The bioinformatics search for α-tubulin genes of Arabidopsis thaliana, Linum usitatissimum, Oryza sativa, Solanum tuberosum, and S. lycopersicum has been carried out. It has been shown that most genes of α-tubulin contained 4-5 exons and 3 to 4 introns. Several exceptions have been identified, including the A. thaliana α-tubulin gene TUBA6 that contained only 2 exons and 1 intron, and the TUBA4 gene that consisted of 3 exons and 2 introns. It have been established that the lengths of the introns varies considerably, even within the same species. A certain systemicity was found in the number of nucleotide pairs of exons. Based on data on the analysis of the α-tubulin gene exon-intron structure, the pair of universal degenerate primers have been created and the evaluation of the 1st intron length polymorphism of α-tubulin genes in Arabidopsis thaliana and various varieties of L. usitatissimum, O. sativa, S. tuberosum, S. lycopersicum have been studied. It was shown the formation of species-specific DNA profiles that contained a different number of first intron amplicons of the α-tubulin genes. The range of the size variation of the amplicons of intron fragments, for example in S. tuberosum, was within 150 bp–2000 bp. The nature of the appearance of large DNA fragments (more than 1500 bp) in the electrophoretic spectra of the analyzed species requires additional research, since such fragments are not generally envisaged by the results of the bioinformatics analysis. The polymorphism of the length of individual fragments of α-tubulin introns among L. usitatissimum, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum varieties has been determined, which allowed to differentiate them among themselves. In general, data was obtained confirming the feasibility of further using the polymorphism of the lengths of the 1st intron of α-tubulin genes to genotyping and assessing the genetic diversity of different species (varieties) of higher plants. The developed DNA marker system is versatile and combines the reliability, speed of obtaining raw data and the simplicity of their analysis.