Створення рослин пшениці з дріжджовими генами біосинтезу трегалози TPS1 і TPS2

Abstract

Введено в культуру in vitro рослини кількох сортів пшениці м'якої (Triticum aestivum L.) і досліджено їх регенераційну здатність. Відібрано сорти Миронівська 67 і Мірхад з метою перенесення в геном дріжджових (Saccharomyces cerevisiae) генів біосинтезу трегалози (TPS1 і TPS2) задля підвищення їх посухостійкості. Перенесення генів здійснювали за допомогою Agrobacterium-опосередкованої трансформації, для цього було створено відповідні векторні конструкції pBract214-TPS1 і pBract214-TPS2 із застосуванням технології Gateway-клонування. Як експланти для трансформації використовували незрілі зародки пшениці. В експериментах було використано штами A. tumefaciens GV3101, які несли окремо конструкції pBract214-TPS1 і pBract214-TPS2 з цільовими генами TPS1 та TPS2 відповідно, що знаходились під контролем промотору убіхітину кукурудзи PUbi, і селективним маркерним геном гігроміцин-фосфотрансферази (hpt). Селекцію трансгенних ліній здійснювали на поживних середовищах у присутності гігроміцину. Трансгенну природу отриманих ліній підтверджували за допомогою ПЛР-методу з використанням специфічних праймерів до генів TPS1 та TPS2.

Plants of several common wheat varieties (Triticum aestivum L.) were established in in vitro culture, and their ability of plant regeneration was studied. In order to obtain plants with enhanced drought tolerance, varieties Myronivska 67 and Myrkhad were picked up for a further transfer of yeast (Saccharomyces cerevisiae) trehalose biosynthesis genes (TPS1 and TPS2) into their genomes. For this purpose, constructs pBract214-TPS1 and pBract214-TPS2 were created using the Gateway-cloning technique. Both constructs contained TPS1 and TPS2 genes under the control of the constitutive maize ubiquitin promoter (PUbi) and hygromycin-phosphotransferase (hpt) selectable marker gene. Transformation was carried out with the use of two A. tumefaciens strains GV3101 carrying the constructions pBract214-TPS1 and pBract214-TPS2. Wheat immature embryos were used as explants for the transformation. Selection of transgenic lines was carried out on nutrient medium supplemented with 30 mg/L hygromycin (as selective agent). The presence of yeast TPS1 and TPS2 sequences in genomic DNA isolated from transgenic wheat plants was confirmed by the PCR analysis using primers specific to these genes.

Введены в культуру in vitro растения нескольких сортов пшеницы (Triticum aestivum L.) и исследован их регенерационный потенциал. Отобраны сорта Мироновская 67 и Мирхад с целью интеграции в их геном дрожжевых (Saccharomyces cerevisiae) генов биосинтеза трегалозы (TPS1 и TPS2) для повышения их устойчивости к засухе. Перенос генов осуществляли с помощью Agrobacterium-опосредованной трансформации, для этого были созданы соответствующие векторные конструкции pBract214-TPS1 и pBract214- TPS2 с помощью технологии Gateway-клонирования. В качестве эксплантов для трансформации использовали незрелые зародыши пшеницы. В экспериментах использовали штаммы A. tumefaciens GV3101, которые несли отдельно конструкции pBract214-TPS1 и pBract214-TPS2 с целевыми генами TPS1 и TPS2 соответственно, находящимися под контролем промотора убихитина кукурузы PUbi, и селективным маркерным геном гигромицин-фосфотрансферазы (hpt). Селекцию трансгенных растений осуществляли на питательных средах в присутствии гигромицина. Трансгенную природу пол ученых линий подтверждали с помощью ПЦР-метода с использованием специфических праймеров к генами TPS1 и TPS2.