RTK signaling regulator SPRY2 associates with endocytic adaptor ITSN1 in vivo

Abstract

Передача митогенного сигнала от RTK (рецепторных тирозиновых киназ) тесно связана с эндоцитозом, регулирующим ее точность. Интерсектин 1 (ITSN1) – эволюционно-консервативный адапторный белок, вовлеченный в самые ранние стадии клатринопосредованного эндоцитоза, а также в злокачественную трансформацию в случае его сверхэкспрессии. Цель. Поиск белков, способных обеспечивать связь ITSN1 с процессом передачи сигнала от RTK. Методы. Предсказание мотивов взаимодействия in silico, экспрессия белков в бактериальной системе и в культуре клеток млекопитающих, иммунопреципитация, преципитация белков, слитых с GST, иммунофлуоресцентный анализ. Результаты. С применением сервиса «Scansite» предсказано связывание домена SH3A ITSN1 с SPRY2. Для экспериментального подтверждения этого взаимодействия GST-слитые домены ITSN1 получены и очищены из клеток Escherichia coli. Используя преципитацию белков, слитых с GST, установлено, что домены SH3A, N-SH3A (нейрон-специфический вариант), SH3C и SH3E способны преципитировать SPRY2-Flag из лизата клеток. Данные иммунофлуоресцентного анализа и коиммунопреципитации свидетельствуют о частичной колокализации белков Omni-ITSN1 и Flag-SPRY2 и формирование ими комплекса in vivo. Выводы. Полученные данные подтверждают ассоциацию эндоцитозного адапторного белка ITSN1 с сигнальным белком SPRY2 in vivo. Ключевые слова: интерсектин 1, передача митогенного сигнала, SPRY2, домен SH3.

Передача мітогенного сигналу від рецепторних тирозинкіназ (RTK) у клітині тісно пов’язана з ендоцитозом, який регулює точність такої передачі. Інтерсектин 1 (ITSN1) – це еволюційно консервативний адапторний білок, що бере участь у найбільш ранніх етапах клатрин-опосередкованого ендоцитозу та залучений до процесу злоякісної трансформації за умов надекспресії. Мета. Пошук білків, які можуть забезпечити зв’язок ITSN1 із процесом передачі сигналу від RTK. Методи. Передбачення мотивів взаємодії in silico, експресія білків у бактерійній системі та культурі клітин ссавців, імунопреципітація, преципітація білків, злитих з GST, імунофлуоресцентні дослідження. Результати. За допомогою сервісу «Scansite» передбачено зв’язування домену SH3A ITSN1 із SPRY2. Для експериментального підтвердження цієї взаємодії злиті з GST SH3-домени ITSN1 отримано і очищено з бактерій Escherichia coli. Використовуючи преципітацію білків, злитих з GST, встановлено, що домени SH3A, N-SH3A (нейрон-специфічний варіант), SH3C і SH3E ITSN1 здатні преципітувати Flag-SPRY2 з лізату клітин. Дані імунофлуоресцентного аналізу та коімунопреципітації свідчать про часткову колокалізацію білків Omni-ITSN1 і Flag-SPRY2 та формування ними комплексу in vivo. Висновки. Отримані дані підтверджують асоціацію ендоцитозного адапторного білка ITSN1 із сигнальним білком SPRY2 in vivo. Ключові слова: інтерсектин 1, передача мітогенного сигналу, SPRY2, домен SH3.