Study of the activity of DNA polymerases β and λ using 5-formyluridine containing DNA substrates

Abstract

Цель. Исследовать TLS-активность ДНК-полимераз β и λ человека на ДНК-дуплексах, содержащих 5-формилуридин (5-foU) и имитирующих интермедиаты репликации лидирующей цепи геномной ДНК, а также влияние на нее репликативных факторов hRPA и hPCNA. Методы. «Задержка в геле» (EMSA), ферментативная кинетика. Результаты. Изучена способность ДНК-полимераз β и λ катализировать синтез ДНК через 5-foU. Определены кинетические характеристики этого процесса в отсутствие и в присутствии белковых факторов hRPA и hPCNA. Выводы. Показано, что: 1) оба фермента способны вести TLS на использованных ДНК-субстратах независимо от условий реакции, однако ДНК-полимераза λ оказалась более точным ферментом; 2) hRPA стимулирует эффективность немутагенного TLS, катализируемого ДНК-полимеразой λ, непосредственно при встраивании нуклеотида напротив 5-foU и не влияет на эффективность этого процесса в том случае, когда повреждение сдвинуто в дуплексную часть ДНК; 3) hPCNA не влияет на эффективность TLS, катализируемого обоими ферментами. Kлючевые слова: синтез ДНК через повреждение, ДНК-полимеразы β и λ, 5-формилуридин.

Мета. Дослідити активність TLS ДНК-полімераз β і λ людини на ДНК-дуплексах, які містять 5-формілуридин (5-foU) та імітують інтермедіати реплікації лідируючого ланцюга геномної ДНК, а також вплив на неї реплікативних факторів hRPA и hPCNA. Методи. «Затримка в гелі» (EMSA), ферментативна кінетика. Результати. Вивчено здатність ДНК-полімераз β і λ активувати синтез ДНК через 5-foU. Визначено кінетичні характеристики цього процесу за відсутності та в присутності білкових факторів hRPA і hPCNA. Висновки. Показано, що 1) обидва ферменти можуть вести TLS на використаних ДНК-субстратах незалежно від умов реакції, однак ДНК-полімераза λ виявилася точнішим ферментом; 2) hRPA стимулює ефективність немутагенного TLS, каталізованого ДНК-полімеразою λ, безпосередньо при вбудовуванні нуклеотиду навпроти 5-foU і не діє на ефективність цього процесу у тому разі, коли пошкодження зсунуте в дуплексну частину ДНК; 3) hPCNA не впливає на ефективність TLS, каталізованого обома ферментами Ключові слова: синтез ДНК через пошкодження, ДНК-полімерази β і λ, 5-формілуридин.

Aims. To investigate the TLS-activity of human DNA polymerases β and λ (pols β and λ) using 5-formyluridine (5-foU) containing DNA duplexes which are imitating the intermediates during replication of the leading DNA strand, and to study the influence ofreplication factors hRPA and hPCNA on this activity. Methods. The EMSA and the methods of enzyme’s kinetics were used. Results. The capability of pols β and λ to catalyze DNA synthesis across 5-foU was investigated and the kinetic characteristics of this process in the presence and in the absence of protein factors hRPA and hPCNA were evaluated. Conclusions. It was shown that: (i) both proteins are able to catalyze TLS on used DNA substrates regardless of the reaction conditions, however, pol λ was more accurate enzyme; (ii) hRPA can stimulate the efficacy of the nonmutagenic TLS catalyzed by pol λ at the nucleotide incorporation directly opposite of 5-foU, at the same time it doesn’t influence the incorporation efficacy if the damage displaced into the duplex; (iii) hPCNA doesn’t influence the efficacy of TLS catalyzed by both enzymes. Keywords: translesion synthesis, DNA polymerases β and λ, 5-formyluridine.