Up-dating the Cholodny method using PET films to sample microbial communities in soil

Abstract

The aim of this work was to investigate the use of PET (polyethylene terephtalate) films as a modern development of Cholodny’s glass slides, to enable microscopy and molecular-based analysis of soil communities where spatial detail at the scale of microbial habitatsis essential to understand microbial associations and interactions in this complex environment. Methods. Classical microbiological methods; attachment assay; surface tension measurements; moleculartechniques: DNA extraction, PCR; confocal laserscanning microscopy (CLSM); micro-focus X-ray computed tomography (µCT). Results. We first show, using the model soil and rhizosphere bacteria Pseudomonas fluorescens SBW25 and P. putida KT2440, that bacteria are able to attach and detach from PET films, and that pre-conditioning with a filtered soil suspension improved the levels of attachment. Bacteria attached to the films were viable and could develop substantial biofilms. PET films buried in soil were rapidly colonised by microorganisms which could be investigated by CLSM and recovered onto agar plates. Secondly, we demonstrate that µCT can be used to non-destructively visualise soil aggregate contact points and pore spaces across the surface of PET films buried in soil. Conclusions. PET films are a successful development of Cholodny’s glass slides and can be used to sample soil communities in which bacterial adherence, growth, biofilm and community development can be investigated. The use of these films with µCT imaging in soil will enable a better understanding of soil micro-habitats and the spatially-explicit nature of microbial interactions in this complex environment. Keywords: Pseudomonas, soil, buried slide, PET film.

Мета цієї роботи полягала у дослідженні можливості використання плівок, виготовлених із ПЕТ (поліетилентетрафталат), як модифікації методу скелець обростання Холодного для мікроскопічного і молекулярно-генетичного аналізу ґрунтових спільнот із збереженням їхньої просторової архітектури на мікрорівні. Таке збереження деталей просторового розташування об’єктів дозволило б глибше вивчити їх у подібних складних середовищах проживання. Методи. Класичні мікробіологічні методи; аналіз прикріплення; вимірювання поверхневого натягнення; молекулярно-генетичні методи: екстракція ДНК, ПЛР; конфокальна лазерна скануюча мікроскопія (КЛСМ); мікрофокусна рентгенівська комп’ютерна томографія (мікроКТ). Результати. По-перше, використовуючи модельні ґрунтові і ризосферні бактерії Pseudomonas fluorescens SBW25 і P. putida KT2440, ми показали, що бактерії здатні до прикріплення і відкріплення від ПЕТ плівок, а прекультивація за умов відфільтрованої ґрунтової суспензії покращує рівень прикріплення. Бактерії, які прикріпилися до плівок, зберігають свою життєздатність і спроможні до формування повноцінної біоплівки. ПЕТ плівки, занурені в ґрунт, колонізуються мікроорганізмами, що спостерігали як за допомогою КЛСМ, так і методом культивування ПЕТ плівок, видалених з ґрунту, на агаризованому поживному середовищі. По-друге, ми продемонстрували, що мікроКТ можна використовувати для неруйнівного спостереження сайтів зв’язування ґрунтових агрегатів і ґрунтових пор з поверхнею плівки, що перебуває в ґрунті. Висновки. Застосування ПЕТ плівок виявилося вдалою модифікацією методу скелець обростання Холодного та може бути корисним для відбору ґрунтових мікробних спільнот, дослідження бактерійного прикріплення, росту і розвитку як біоплівок, так і спільноти. Використання цих плівок при аналізі ґрунтів за допомогою мікроКТ дозволить краще визначити ґрунтові мікроеконіші і природу архітектури мікробних взаємодій за таких складних екологічних умов. Ключові слова: Pseudomonas, ґрунт, скельця обростання, ПЕТ плівки.

Цель данной работы состояла в исследовании возможности использования плeнок, изготовленных из ПЭТ (полиэтилентерефталат), как современной модификации метода стeкол обрастаний Холодного для микроскопического и молекулярно-генетического анализа почвенных сообществ с сохранением их пространственной архитектуры на микроуровне. Такая сохранность деталей пространственного расположения объектов позволила бы глубже изучить их в подобных сложных условиях обитания. Методы. Классические микробиологические методы; анализ прикрепления; измерение поверхностного натяжения; молекулярногенетические методы: экстракция ДНК, ПЦР; конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ); микрофокусная рентгеновская компьютерная томография (микроКТ). Результаты. Во-первых, используя модельные почвенные и ризосферные бактерии Pseudomonas fluorescens SBW25 и P. putida KT2440, мы показали, что бактерии способны к прикреплению и откреплению от ПЭТ плeнок, а прекультивирование в условиях отфильтрованной почвенной суспензии улучшает уровень прикрепления. Бактерии, прикреплeнные к плeнкам, сохраняют жизнеспособность и могут формировать полноценную биоплeнку. ПЕТ плeнки, погружeнные в почву, колонизируются микроорганизмами, что наблюдали как с применением КЛСМ, так и методом культивирования извлечe нных из почвы плeнок на агаризованной питательной среде. Во-вторых, мы продемонстрировали, что микроКТ можно использоватьа для недеструктивного наблюдения за сайтами связывания почвенных агрегатов и почвенных пор с поверхностью ПЕТ плeнки, находящейся в почве. Выводы. Применение ПЕТ плeнок оказалось удачной модификацией метода стeкол обрастаний Холодного и может стать полезным для отбора почвенных микробных сообществ, изучения бактериального прикрепления, роста, развития как биоплeнок, так и сообщества. Использование этих плeнок при анализе почвы с помощью микроКТ позволит лучше определять почвенные микроэкониши и природу архитектуры микробных взаимодействий в таких сложных экологических условиях. Ключевые слова: Pseudomonas, почва, стeкла обрастания, ПЭТ плeнки.