Особенности экспрессии целевого гена в составе вектора на основе бактериофага лямбда и изучение путей ее оптимизации

Abstract

Рекомбинантные молекулы на основе бактериофага лямбда отличаются высокой сегрегационной стабильностью в лизогенном состоянии и высоким уровнем амплификации фаговой ДНК и соответственно встроенного в нее целевого гена при литическом развитии фага, которое заканчивается лизисом бактериальной клетки и высвобождением целевого продукта в культуральную среду. Это делает перспективным использование фага лямбда для получения рекомбинантных белков. В данном сообщении описано конструирование фага λpIF, несущего две копии искусствен­ного гена интерферона (ИФН) человека под контролем тандема триптофановых промоторов. Экспрессию чужеродных генов осуществляли термоиндукцией клеток, несущих фаг с генами ИФН, а также инфекцией этим фагом реципиентных клеток. Показано, что выход рекомбинантного белка зависит от оптической плотности клеток при термоиндукции и последующего темпера­турного режима культивирования продуцента Увеличение содержания ИФН в лизатах после индукции также наблюдали при использовании Q–R– амбер-мутантов фага λpIF. Показано, что инфицирование реципиентных клеток фагом λpIF обеспечивало более высокий выход ИФН (около 40 мг/л), чем термоиндукция клеток Escherichia coli, несущих фаг с целевыми генами.

Рекомбінантні молекули на основі бактеріофага лямбда відріз­няються високою сегрегаційною стабільністю у лізогенному стані і високим рівнем ампліфікації фагової ДНК та від­повідно вбудованого в неї цільового гена за літичного розвитку фага, який закінчується лізисом бактеріальної клітини і вивільненням цільового продукту в культуральне середовище. Це робить перспективним використання фага лямбда для отримання рекомбінантних білків. У даному повідомленні описано конструювання фага λpIF, який несе дві копії штучно­го гена інтерферону (ІФН) людини під контролем тандему триптофанових промоторів. Експресію чужорідних генів здій­снювали термоіндукціею клітин, які несуть фаг з генами ІФН, а також інфекцією цим фагом реципієнтних клітин. Показано, що вихід рекомбінантного білка залежить від оп­тичної густини клітин при термоіндукції і наступного тем­пературного режиму культивування продуцента. Збільшення вмісту ІФН у лізатах після індукції також спостерігали при використанні Q– R– амбер-мутантів фага λpIF. Показано, що інфікування реципієнтних клітин фагом λpIF забезпечує ви­щий вихід ІФН (біля 40 мг/л), ніж термоіндукиія клітин Escherichia coli, які несуть фаг з цільовими генами.

High stability of the cloned gene in the lysogenic state and high copy number in the lytic state suggest a potential use of phage λ as an expression vector for overproduction of the extracellular recombinant proteins which release to the growth medium as a result of lysis of E. coli cells by phage. This paper describes the construction and characterization of phage λpIF carrying the two copy of an artificial gene for human α2 interferon (IFN) under control of the Ptrp tandem promoter. The expression of the foreign genes realized by thermal induction cells carrying the phage λpIF as well as by infection of recipient cells with this phage. In this study it was shown that the recombinant protein yield is dependent on a cell density at the time of thermal induction and the following temperature of producer cultivation. The increase of soluble target protein concentration in lysates after induction of recombinant phage was also observed using the phage λpIF contains amber-mutations in genes Q and R. The infection of recipient cells by phage λpIF resulted in higher IFN yield (about 40 mg per l) than thermal induction of the cells carrying the phage λ with target genes.