Исследование взаимодействия бромистого этидия с самокомплементарным дезокситетрануклеотидом 5-d(A)СpGpT) в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии

Abstract

Изучено комплексообразование красителя бромистого этидия (3,8-диамино-6-фенил-5-этил-фенантридин) с самокомплементарным дезокситетрарибонуклсозидтрифосфатом 5'-d(ApCpGpT) в водно-солевом растворе методом одномерной (500 МГц) и двухмерной (600 МГц) ¹Н-ЯМР спектроскопии. Двухмерная гомоядерная ПМР спектроскопия (2М-NOESY) использована для качествен, о го анализа характера взаимодействия бромис­того этидия с тетрануклеотидом. Измерены концентрационные зависимости протонных химических сдвигов молекул при фиксированной температуре (Т=298 К). Рассмотрены различные схемы комплексообразования молекул красителя с тетрануклеотидом, учи­тывающие разные молекулярные ассоциаты в растворе. Определены равновесные кон­станты реакций и предельные значения химических сдвигов протонов бромистого эти­дия в составе комплексов. Проанализировано относительное содержание комплексов различного типа в растворе и выявлены особенности динамического равновсия в за­висимости от соотношения концентраций красителя и тетрануклеотида. На основе по­лученных данных сделано заключение о преимущественной интеркаляции бромистого этидия в пиримидин-пуриновый участок тетрануклеотидной последовательности (CG-сайт) в дуплексной форме подобно изученному ранее акридиновому красителю профлавину. Встраивание бромистого этидия происходит со стороны малой канавки дуп­лекса, в отличие от профлавина, интеркалирующсго из большого желобка двойной спи­рали. Построена наиболее вероятная структура 1 : 2 красителя с тетрануклеотидом в растворе по расчетным значениям индуцированного химического сдвига протонов бро­мистого этидия и данным 2M-NOE-cпектpe.

Вивчено комплексоутворення барвника бромистого етидію (3,8-Дтміно-6-феніл-5-етил-фенантридин) з самокомплементарним дезокситетрарибонуклеозидтрифосфатом 5'-d (ApCpGpT) у водно-солевому розчині методом одномірної (500 МГц) і двомірної (600 МГц) *Н-ЯМР спектроскопії. Двомірну гомоядерну ПМР спектроскопію (2M-NOESY) викоріистано для якісного аналізу характера взаємодії бромистого етидію з тетрануклеотидом. Виміряно концентраційні залежності протонних хімічних зсувів молекул при фіксованій температурі (Т = 298 К). Розглянуто різноманітні схеми ком­плексоутворення молекул барвника з тетрануклеотидом, які враховують різні моле­кулярні асоціати у розчині. Визначено рівноважні константи реакцій і граничні зна­ чення хімічних зсувів протонів бромистого етидію у складі комплексів. Проаналізовано відносний вміст комплексі© різного типу у розчині і выявлено особливості динамічної рівноваги в залежності від співвідношення концентрацій барвника і тетрануклеотиду. На основі отриманих даних зроблено висновок щодо переважної інтеркаляції броми­стого етидію у піримідин-пуринову ділянку тетрануклеотидної послідовності (CG-сайт) у дуплексній формі подібно до вивченого раніше акридинового барвника профлавіна. Вбудовування бромистого етидію відбувається з боку малої канавки дуплексу на від­міну від профлавіна, інтеркалюючого з великого жолобка подвійної спіралі. Побу­довано найвірогіднішу структуру 1:2 барвника з тетрануклеотидом у розчині виходячи з розрахованих значень індукованого хімічного зсуву протонів бромистого етидію і даних 2M-NOE-cneKTpiB.

Complex formation between dye ethidium bromide (3,8-diamino-6-phenyl-5-etliyl-phenan-thridinium) and self-complementary deoxytetraribonucleoside triphosphate 5'd-(ApCpGpT) in aqueous salt solution has been studied by method of one-dimensional (500 MHz) and two-dimensional ¹H NMR spectroscopy (600 MHz). Two-dimensional homonuctear ¹H NMR spectroscopy was used for qualitative analysis of the nature of interactions of ethidium bromide with tetranucleotide. Concentration dependences of proton chemical shifts of the molecules have been measured at fixed temperature (T=298K). Different schemes of complex formation between dye molecules and tetranucleotide have been examined taking into account various molecular associations in solution. Analysis of the relative content of different types of complexes has been made and special features of dynamic equilibrium have been revealed as a function of both the dye and tetranuclee-tide concentrations. The present analysis leads to the conclusion that ethidium bromide binds preferentially to pyrimidine-purine sequence (CG-site) of the tetranucleotide duplex similar to the observed proflavine-(ApCpGpT) binding studied earlier. Ethidium bromide intercalates from the minor groove of the double helix in contrast to proflavine which binds from the major groove. The most favourable structure of the 1:2 complex of dye with the tetranucleotide has been constructed using calculated values of induced chemical shifts of ethidium bromide protons in conjunction with intermolecular NOEa.