SDS-dependent cleavage of nuclear DNA into high molecular weight DNA fragments: a signal to the engagement of apoptosis?

Abstract

In this paper we employed an extraction of the cells with high concentration of sodium chloride (a procedure commonly used for preparation of histone-depleted nuclei) to investigate the genesis of nuclear DNA degradation during apoptosis. We demonstrated that apoptosis in primary culture of murine thymocytes and in continuously growing Swiss 3T3 fibroblasts is associated with progressive disintegration of nuclear DNA into high molecular weight (HMW) DNA fragments of about 50–150 kb followed by the development of oligonucleosomai DNA ladder. In apoptotic cells both HMW DNA cleavage and internucleosomal DNA fragmentation can be detected cither by cell treatment with ionic detergents (SDS) or by extraction with high concentration of sodium chloride. However, at the early stage of apoptosis only SOS-detected HMW-DNA cleavage can be observed which precedes the sodium-chloride-detected nuclear DNA degradation. SDS-detected but not sodium-chloride-detected formation of HMW-DNA fragments occurs in apoptotic cells as early as before detachment. It may be observed also in nonapoptotic cells after they reach t/ic confluent state and is reversible. On the basis of obtained results it is possible to suggest thai SDS-detected HMW-DNA cleavage represents a physiological reaction of alive cells that accompanies an early commitment step of apoptosis.

У роботі застосовано метод високосолевої екстракції ін­тактних клітин для вивчення динаміки розщеплення ядерної ДНК при апоптозі. Показано, що апоптоз в первинній куль­турі тимоцитів і культивованих прикріплених клітинах фіб­робластів мииіі супроводжується прогресивною деградацією ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти розміром 50–150 тис. п. н. з подальшим формуванням олігонуклеосомних фрагментів. В апоптозних клітинах розщеплення ядерної ДНК на високо молекулярні та олігонуклеосомні фрагменти відбувається як при обробці клітин DS-Na, так і при високо-солевій, екстракції. Однак на ранніх етапах апоптозу має місце лише DS-Na-залежна високомолекулярна фрагментація ядерної ДНК, яка передує формуванню високо молекулярних фрагментів, що виявляються при високосолевій екстракції клітин. На відміну від розривів, які виявляються високосолевою екстракцією, DS-Na-залежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фрагменти спостерігається в апоптозних клітинах перед вспливанням, а також має місце в неапоптозних клітинах, що досягли моношару. Показано, що DS-Na-за­лежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фраг­менти на початкових стадіях апоптозу є зворотним в умо­вах, що сприяють залежному від топоізомерази II лігуванню розривів ДНК. Отримані результати свідчать, що DS-Na-за­лежне розщеплення ядерної ДНК на високомолекулярні фраг­менти є фізіологічною реакцією живих клітин, яка передує апоптозній деградації ядерної ДНК.

В работе применен метод высокосолевой экстракции интактных клеток для изучения динамики расщепления ядерной ДНК при апоптозе. Показано, что апоптоз в первичной культуре тимоцитов и культивированных прикрепляющихся клетках фибробластов мыши сопровождается прогрессивной деграда­цией ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты разме­ром 50–150 тыс. п. н. с последующим формированием олигонуклеосомных фрагментов. В апоптозных клетках расщепле­ние ядерной ДНК на высокомолекулярные и олигонуклеосомные фрагменты происходит как при обработке клеток DS-Na, так и при высокосолевой экстракции. Однако на ранних этапах апоптоза имеет место лишь DS-Na-зависимая высокомолекулярная фрагментация ядерной ДНК, предшествую­щая формированию высокомолекулярных фрагментов, выявляемых высокосолевой экстракцией клеток. В отличие от разрывов, обнаруживаемых высокосолевой экстракцией, DSNa-зависимое расиитление ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты наблюдается в апоптозных клетках перед всплытием, а также имеет место в неапоптозных клетках, достигших монослоя. Показано, что DS-Na-зависимое расщеп­ление ядерной ДНК на. высокомолекулярные фрагменты на начальных стадиях апоптоза является обратимым в услови­ях, способствующих опосредованному топоизомеразой II лигированию разрывов ДНК. Полученные результаты свидетельствуют, что DS-Na-зависимое расщепление ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты представляет собой физио­логическую реакцию живых клеток, которая, предшествует апоптозной деградации ядерной ДНК.