Препаративное получение рибоолигонуклеотидов заданного строения путем транскрипции дезоксирибоолигонуклеотидов

Abstract

Транскрипция дезоксирибоолигонуклеотидных матриц в системе РНК-полимеразы Escherichia coli является одним из перспективных методов получения рибоолигонуклеотидов заданного строения. Для получения препаративных количеств AGGGGAUUGAAAAUC-фрагмента антикодоновой петли фенилаланиновой тРНК и AUGAGGAAUACCCAUG-фрагмента РНК фага MS2 проведена транскрипция комплементарных дезоксирибоолигонуклеотидов. Уровень включения нуклеотидов в продукт транскрипции при этом составил не менее 70 % нуклеотидного материала матрицы. Разработана процедура извлечения транскрипта из реакционной смеси, включающая хроматографию на гепарин-агарозе, хроматографию на гидрофобном сорбенте Lichroprep RP18 и электрофорез в 20 %-ном полиакриламидном геле (ПААГ) с последующей электроэлюцией целевого продукта из геля. При использовании в РНК-полимеразной реакции 5 о. е. A₂₆₀ дезоксирибоматрицы конечный выход точной РНК-копии составил 1,0—1,5 о. е. A₂₆₀.

Транскрипція дезоксирибоолігонуклеотидних матриць у системі РНК-полімерази Escherichia coli є одним із перспективних методів отримання рибоолігонуклеотидів заданої будови. Для одержання препаративних кількостей AGGGGAUUGAAAAUC-фрагмента антикодонової петлі фенілаланінової тРНК і AUGAGGAAUACCCAUG-фрагмента РНК фага MS2 проведено транскрипцію комплементарних дезоксирибоолігонуклеотидів. Рівень включення нуклеотидів у продукт транскрипції при цьому становив не менше 70 % нуклеотидного матеріалу матриці. Розроблено процедуру вилучення транскрипта з реакційної суміші, що включає хроматографію на гепарин-агарозі, хроматографію на гідрофобному сорбенті Lichroprep RP18 і електрофорез у 20 %-му поліакриламідному гелі з подальшою електроелюцією цільового продукту з гелю. При використанні в РНК-полімеразній реакції 5 о. о. A₂₆₀ дезоксирибоматриці кінцевий вихід точної РНК-копії склав 1,0–1,5 о. о. A₂₆₀.

The transcription of complementary deoxyribooligonucleotides was performed to obtain AGGGGAUUGAAAAUC (tRNAphe anticodon loop fragment) and AUGAGGAAUACCCAUG (the MS2 phase RNA fragment) in preparative amounts. The nucleotide incorporation into the transcription product was shown to achieve 70 % of the template nucleotide level. The procedure was developed for the isolation of the transcript from the reaction mixture. The isolation steps involve geparine-agarose chromatography, Lichroprep RP 18 one and the electrophoresis in 20 % polyacrylamide gel under denaturation conditions followed by electroelution of the desired product from gel. Being an exact copy of deoxyribotemplate the ribooligonucleotide gave the yield of 1.0–1.5 U₂₆₀ on 5.0 U₂₆₀ of the template.