Leucine-zipper motif is responsible for self-association of translation elongation factor 1Bβ

Abstract

Translation elongation factor 1Bβ (eEF1Bβ) is a metazoan-specific protein catalyzing the guanine nucleotide exchange on translation elongation factor 1A (eEF1A). eEF1Bβ was reported to form oligomers. Aim. To define the structural region of human eEF1Bβ that mediates its self-association. In addition, the various truncated forms of this protein were tested in the guanine nucleotide exchange assay with two isoforms of mammalian eEF1A. Methods. The truncated forms of eEF1Bβ were generated by PCR, cloned, expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. Their apparent molecular masses were determined by analytical gel filtration and their guanine nucleotide exchange activities were assessed by filter binding assay. Results. Complete deletion of the N-terminal domain of eEF1Bβ does not affect its oligomerization propensity while deletion of the leucine-zipper motif drastically decreases the apparent molecular mass of the truncated form compared to the full-length protein. Also, the leucine-zipper motif of eEF1Bβ fused to glutathione S-transferase causes oligomerization of the chimeric protein. It was demonstrated that all N-terminally truncated forms of eEF1Bβ displayed similar catalytic activity to that of the full-length protein. Weak inhibitory effect on the catalytic activity was observed only for the truncated form with partially deleted central acidic region. Conclusions. The leucine-zipper motif facilitates oligomerization of recombinant eEF1Bβ. Stepwise deletion of the eEF1Bβ N-terminal domain does not significantly affect the guanine nucleotide exchange activity of the truncated proteins.

Фактор елонгації трансляції 1Bβ(eEF1Bβ) – це білок, наявний лише у багатоклітинних організмів. Він каталізує обмін гуанінових нуклеотидів на факторі елонгації трансляції 1A (eEF1A). Відомо, що eEF1Bβ утворює олігомери. Мета. Визначити структурний домен eEF1Bβ людини, який опосередковує його олігомеризацію. Для встановлення ймовірного впливу N-кінцевої ділянки eEF1Bβ на каталітичну активність цього білка, було перевірено здатність різних вкорочених форм eEF1Bβ каталізувати обмін гуанінових нуклеотидів на обох ізоформах eEF1A ссавців. Методи. Фрагменти кДНК, які кодують вкорочені форми, eEF1Bβ отримували шляхом ПЛР ампліфікації, потім клонували у відповідні вектори, які експресували в клітинах Escherichia coli. Рекомбінантні білки очищали і їхні молекулярні маси визначали аналітичною гель-фільтрацією. Активність вкорочених форм eEF1Bβ перевіряли в реакції обміну гуанінових нуклеотидів. Результати. Видалення N-кінцевого домену eEF1Bβ не вплинуло на його олігомерізацію, в той час як видалення мотиву типу «лейцинова застібка» значно зменшувало молекулярну масу вкороченої форми білка в порівнянні з повнорозмірною. Також, амінокислотний мотив eEF1Bβ типу «лейцинова застібка» злитий з глутатіон S-трансферазою спричиняв олігомерізацію цього химерного білка. Показано, що всі вкорочені з N-кінця форми eEF1Bβ проявляли каталітичну активність, подібну до повнорозмірного білка. Інгібіторний ефект на каталітичну активність спостерігався лише для вкороченої форми білка, в якої була відсутня частина центрального негативно зарядженого регіону. Висновки. Амінокислотний мотив типу «лейцинова застібка» сприяє олігомерізації рекомбінантного eEF1Bβ. Поступове вкорочення N-кінцевого домену не має значного впливу на каталітичну активність eEF1Bβ.

Фактор элонгации трансляции 1Bβ (eEF1Bβ) – белок, присутствующий только в многоклеточных организмах. Он катализирует обмен гуаниновых нуклеотидов на факторе элонгации трансляции 1A (eEF1A). Известно, что eEF1Bβ образует олигомеры. Цель. Определить структурный домен eEF1Bβ человека, который вызывает его олигомеризацию. Для исследования возможного влияния N-концевого участка eEF1Bβ на каталитическую активность этого белка, мы проверили способность различных укороченных форм eEF1Bβ катализировать обмен гуаниновых нуклеотидов на обеих изоформах eEF1A млекопитающих. Методы. Фрагменты кДНК, кодирующие укороченные формы eEF1Bβ, получали при помощи ПЦР амплификации, потом клонировали в соответствующие вектора, которые экспрессировали в клетках Escherichia coli. Рекомбинантные белки очищали и их молекулярные массы определяли аналитической гель-фильтрацией. Активность укороченных форм eEF1Bβ проверяли в реакции обмена гуаниновых нуклеотидов. Результаты. Полное удаление N-концевого домена не влияло на олигомеризацию eEF1Bβ, однако удаление мотива типа «лейцинова застёжка» значительно уменьшало молекулярную массу укороченной формы белка по сравнению с полноразмерной. Также, присоединение аминокислотного мотива eEF1Bβ типа «лейциновая застёжка» к глутатион S-трансферазе вызвало олигомеризацию этого химерного белка. Показано, что все укороченные с N-конца формы eEF1Bβ проявляли такую же каталитическую активность, как и полноразмерный белок. Слабый ингибирующий эффект на каталитическую активность наблюдался лишь для укороченной формы белка с отсутствующей частью центрального негативно заряженного региона. Выводы. Аминокислотный мотив типа «лейциновая застёжка» способствует олигомеризации рекомбинантного eEF1Bβ. Постепенное укорочение N-концевого домена не оказывает значительного влияния на каталитическую активность eEF1Bβ.