Construction, expression, functional characterization and practical application of fusion protein SPA-BAPmut

Abstract

Aim. The creation of genetically engineered fusion protein SPA-BAPmut and its application as a secondary immunoreagent in immunoassays. Methods. Gene cloning, PCR, electrophoresis, DNA sequencing, bacteria cells culturing, protein expression and purification, ELISA, Western-blotting were used. Results. The DNA sequences encoding Staphylococcus aureus protein A (SPA) and bacterial alkaline phosphatase with enhanced catalytic activity (BAPmut) were used for construction of gene encoding fusion protein SPA-BAPmut that was expressed in the high-productive Escherichia coli system and obtained in a soluble form. Cultivation conditions to provide a high-level expression of SPA-BAPmut (> 1 g/l) were determined. The target protein was obtained with purity more than 95 % using IMAX method. SPA-BAPmut is thermostable, and both parts of fusion protein (SPA and BAPmut) retain their IgG binding and alkaline phosphatase activity for a long time. SPA-BAPmut was used as a substitute of secondary antibodies in immunoassays. As little as 5 ng of the antigen could be detected in Western blotting and 1 g/ml of IgG in ELISA. Conclusions. The possibility of using SPA-BAPmut as universal secondary immunoreagent for different types of immunoassays was shown.

Мета. Створення генно-інженерного злитого білка SPA-BAPmut та його застосування як вторинного імунореагенту в імунологічних тестах. Методи. Клонування генів, ПЛР, секвенування ДНК, культивування бактерій, електрофорез, синтез і очищення білків, ELISA, вестерн-блот. Результати. З використанням послідовновностей ДНК, що кодують білок А Staphylococcus aureus (SPA) і бактерійну лужну фосфатазу з покращеними каталітичними властивостями (BAPmut), сконструйовано ген злитого білка SPA-BAPmut та забезпечено його препаративне отримання у розчинній формі внаслідок синтезу в клітинах Escherichia coli. Визначено умови ферментації, за яких вихід SPA-ВAPmut становить приблизно 1 г/л культури E. coli. Із застосуванням методу металоафінної хроматографії одержано цільовий білок з чистотою понад 95 %. SPA-ВAPmut термостабільний, а обидва його компоненти (SPA і ВAPmut) зберігають імуноглобулінзв’язувальну і фосфатазну активність тривалий час. SPA-BAPmut дозволяє виявляти щонайменше 5 нг антигену та 1 мкг/мл антитіл. Висновки. Показано можливість використання SPA-ВAPmut як універсального вторинного імунореагенту в імунохімічних тестах.

Цель. Создание генно-инженерного слитого белка SPA-BAPmut и eго использование как вторичного иммунореагента в иммунологических тестах. Методы. Клонирование генов, ПЛР, секвенирование ДНК, культивирование бактерий, электрофорез, биосинтез и очистка белков, ELISA, вестерн-блот. Результаты. С использованием последовательностей ДНК, кодирующих белок А Staphylo- coccus aureus (SPA) и бактериальную щелочную фосфатазу с улучшенными каталитическими свойствами (BAPmut), сконструирован ген слитого белка SPA-BAPmut и обеспечено его препаративное получение в растворимой форме вследствие синтеза в клетках Escherichia coli. Определены условия ферментации, при которых выход SPA-ВAPmut составляет около 1 г/л культуры E. coli. С применением метода металлоаффинной хроматографии целевой белок получен с чистотой более 95 %. SPA-ВAPmut термостабилен, а оба его компонента (SPA и ВAPmut) сохраняют иммуноглобулинсвязывающую и фосфатазную активность на протяжении длительного времени. SPA-BAPmut позволяет детектировать 5 нг антигена и 1 мкг/мл антител. Выводы. Показана возможность применения SPA-ВAPmut как универсального вторичного иммунореагента в иммунохимических тестах.