Количественное изучение взаимодействия деацилированной тРНК с Р-, А- и Е-сайтами 70 S рибосом Escherichia coli

Abstract

В работе определены зависимости констант ассоциации деацилированной тРНК^Phe с Р-сайтом рибосом от концентрации ионов Mg²⁺ и температуры; измерена константа ассоциации тРНК^Phe с А-сайтом; показано, что с изменением концентрации Mg²⁺ и температуры взаимодействие тPHK^Phe с Е-сайтом остается кодоннезависимым. На основе полученных и ранее нами опубликованных данных построены ряды относительного сродства аминоацил-тРНК, пептидил-тРНК и деацилированной тРНК к Р-, А- и Е-сайтам 70S рибосомы, а также предлагается термодинамически обоснованная модель транслокации с использованием Е-сайта как выходного.

Визначено залежності констант асоціації деацильованої тРНК^Phe з Р-сайтом рибосом від концентрації іонів Mg²⁺ і температури; виміряно константу асоціації тРНК^Phe з А-сайтом; показано, що із зміною концентрації Mg²⁺ і температури взаємодія тPHK^Phe з Е-сайтом залишається кодоннезалежною. На основі отриманих та опублікованих нами раніше даних побудовано ряди відносної спорідненості аміноацил-тРНК, пептидил-тРНК і деацильованої тРНК до Р-, А- та Е-сайтів 70S рибосоми, а також запропоновано термодинамічно обгрунтовану модель транслокації з використанням Е-сайта як вихідного.

The association constants of deacylated tRNA^Phe for the P site of 70S ribosomes were measured in the presence and absence of poly(U), and at different Mg²⁺ concentrations and temperatures. The numbers of Mg²⁺ ions involved in this interaction were determined: 4.4±0.3 (+poly(U) and 2.7±0.3 (–poly(U). The association constant of tRNA^Phe for the A site was found to be 5•10⁵M⁻¹, much lower than that for the P site (2•10⁹M⁻¹), at 15 mM Mg²⁺, 200 mM NH₄⁺ and 25 °C. The independence of the E-site binding of tRNA^Phe on the messenger RNA was confirmed under these medium conditions. Based on the data obtained the affinity orders of aminoacyl-, peptidyl-tRNA and deacylated tRNA for the P, A and E sites are determined, and a possible mechanism of involvement of the E site in the translocation process is discussed.