Оцінка цитотоксичної активності лектиноподібної речовини B. subtilis B-7724 у системі in vitro

Abstract

Мета: оцінка in vitro цитотоксичної дії на пухлинні та імунокомпетентні клітини лектину, виділеного з фільтрату культуральної рідини Bacillus subtilis В-7724 за модифікованим методом. Об’єкт і методи: лектиноподібну речовину (ЛПР) отримували із культуральної рідини В. subtilis В-7724 після 10-добового культивування на стандартизованому середовищі Гаузе. Досліджували in vitro цитотоксичну активність ЛПР проти клітин пухлинних (раку Ерліха, меланоми В16, А549, К562) або умовно нормальних (MDBK) клітинних ліній, а також клітин імунокомпетентних органів інтактних мишей лінії Balb/c. Оцінку цитотоксичного впливу проводили, використовуючи цитоморфологічний аналіз за допомогою світлового мікроскопа та колориметричний МТТ-тест. Статистичну обробку результатів проводили за загальноприйнятими методами. Вірогідність різниці між контрольними та дослідними вимірами оцінювали за t-критерієм Стьюдента. Результати: ЛПР, виділена з середовища росту мікроорганізму B. subtilis В-7724, виявляє дозозалежну цитотоксичну активність щодо клітин різних модельних пухлин: мінімальну активність виявляє в концентрації 0,02 мг/мл, максимальну — 0,1 мг/мл. Серед клітин перевивних пухлинних ліній найбільш чутливою виявилася меланома В16: індекс цитотоксичності (ІЦ) становив 72,3% (0,02 мг/мл) та 97,2% (0,04 мг/мл). Практично нечутливими до цитотоксичної дії ЛПР були клітини лінії К562: ІЦ = 13,4% (0,02 мг/мл) та 22,3% (0,04 мг/мл). Серед клітин імунокомпетентних органів найбільш чутливими до дії ЛПР виявилися клітини тимуса. Більш резистентні клітини макрофагальної ланки: додавання ЛПР в концентрації 0,02 мг/мл практично не мало цитотоксичного впливу: через 60 хв ІЦ = 14,8%, через 24 год — 60,9%. Імунотоксичну дію виявляла концентрація ЛПР 0,1 мг/мл (ІЦ 90,2–99,5%). Висновок: концентрації ЛПР 0,02–0,04 мг/мл у подальшому можуть бути використані в дослідах in vivo як такі, що володіють цитотоксичною активністю щодо пухлинних клітин, але водночас не мають суттєвої імунотоксичної дії. Одержані результати можуть стати підґрунтям для вдосконалення напрямків і методів використання ЛПР B. subtilis B-7724 в онкологічній клінічній практиці.

Objective: in vitro evaluation of cytotoxic activity in relation to tumor cells of various lines and immunotoxic activity of lectin-like substance (LLS) isolated from the culture liquid medium filtrate of В. subtilis В-7724 by the modified method. Object and methods: LLS was obtained from the culture medium B. subtilis B-7724, after 10-day cultivation on a standardized medium. The in vitro cytotoxic activity of LLS was investigated in relation to tumor cells (Ehrlich cancer, melanoma B16, A549, K562) or conditionally normal (MDBK) cell lines, as well as cells of the immune-competent organs of Balb/c intact mice. The evaluation of the cytotoxic effect was performed using a cytomorphological analysis using a light microscope and a colorimetric MTT test. The wells with culture medium and target cells, which did not add the test drug, served as control. Statistical processing of the results was carried out according to commonly accepted methods. The probability of the difference between control and experimental measurements was estimated by the Student t-criterion. Results: LLS isolated from the growth medium of the microorganism В. subtilis В-7724, detects dose-dependent cytotoxic activity in relation to cells of various model tumors: the minimum activity is found at a concentration of 0.02 mg/ml, maximum — 0.1 mg/ml. Among the cells of transplantable tumor lines, the melanoma B16: cytotoxic index (CI) = 72.3 (0.02 mg/ml) and 97.2% (0.04 mg/ml) was the most sensitive. The cells of the K562 line: CI = 13.4 (0.02 mg/ml) and 22.3% (0.04 mg/ml) were virtually insensitive to the LLS of the cytotoxic action. Among the cells of the immunocompetent organs, the most sensitive to the action of LLS were thymus cells. More resistant macrophage cells: adding LLS at a concentration of 0.02 mg/ml practically did not have a cytotoxic effect: after 60 minutes CI = 14.8%, after 24 hours — 60.9%. Immunotoxic effect showed a concentration of LLS 0.1 mg/ml (CI = 90.2–99.5%). Conclusion: LLS concentrations of 0.02–0.04 mg/ml can be used subsequently in vivo experiments as having cytotoxic activity against tumor cells, but at the same time, have no significant immunotoxic activity. The obtained results can form the basis for improving the directions and methods of using В. subtilis В-7724 LLS in oncology clinical practice.