Супероксидні радикали: ініціація метастазування у хворих на рак молочної залози

Abstract

Однією із особливостей розвитку злоякісних пухлин є ремоделювання міжклітинного матриксу, зумовлене активацією матриксних металопротеїназ (MMП) супероксидними радикалами (СР). Мітохондрії (Мх) та NADP∙Hоксидази (Nox) у позаклітинному мікрооточенні є основними джерелами генерування СР, які регулюють активність генів редоксзалежних білків, зокрема ММП. Мета: дослідити рівні СР в Мх клітин раку молочної залози (РМЗ) та їх вплив на активність ММП-2 та -9 і метастазування. Об’єкт і методи: досліджено зразки тканини пухлин 69 хворих на РМЗ І–IV стадії (Т1–4N0–2M0–1) віком від 31 до 75 років: 15 — І, 14 — ІІ, 13 — ІІІ, 27 — ІV стадії захворювання (з них 17 — категорії М1, 10 — М0). Супероксид-генеруючу активність нейтрофілів (Н) крові вивчали методом електронного парамагнітного резонансу на комп’ютеризованому ЕПР-спектрометрі РЕ-1307 з використанням технології Spin Traps за кімнатної температури (1-гідрокси2,2,6,6-тетраметил-4-оксипіперидин). Рівень СР в Мх клітин РМЗ визначали за допомогою спінового уловлювача TEMPO-H. Активність ММП-2 та -9 встановлювали методом зимографії у поліакриламідному гелі. Результати: виявлено пряму кореляційну залежність між активністю ММП-2 та -9 і швидкістю генерування СР Мх клітин РМЗ (r = 0,61, r = 0,56 відповідно; р < 0,05). Встановлено, що після інкубації клітин пухлини з Н, що генерували СР зі швидкістю 1,82 нмоль/10⁵ клітин∙хв, протягом 6 год при t = 37 °С активність ММП-2 і -9 становила 1,43 ± 0,13 і 4,54 ± 0,19 у. о., а їх латентних форм — 1,88 ± 0,16 і 3,88 ± 0,12 у. о. відповідно. Інкубація клітин пухлини з Н, що генерували СР зі швидкістю 4,31 нмоль/10⁵ клітин∙хв, призвела до значного (в 2–3 рази) зростання рівнів активних і латентних форм обох ферментів. Для РМЗ I стадії характерні відносно невисокі значення активності ММП-2 та -9, значно вищі середні показники спостерігаються у хворих на РМЗ ІІ, ІІІ та особливо ІV стадії без метастазів. У хворих категорії М1 відмічено зниження активності ММП-2 та -9 порівняно з хворими групи М0 відповідно у 4 та 2 рази. Висновки: зростання швидкості генерування СР у клітинах пухлини та позаклітинному матриксі є критичною і достатньою подією для активації ММП в пухлинах. При РМЗ СР генеруються Мх і Н, які інфільтрують первинну пухлину. Ступінь індукції СР ММП-2 та -9 визначає злоякісний фенотип пухлин та їхній метастатичний потенціал. Отримані результати свідчать про важливу роль редокс-регуляції активності ММП-2 та -9 на етапах інвазії та утворення віддалених метастатичних вузлів.

One of the features of the malignant tumors development is the remodeling of the intercellular matrix due to the activation of matrix metalloproteinases (MMP) by superoxide radicals (SR). Mitochondria (Mc) and NADP ∙H-oxidase (Nox) in extracellular microenvironment are the main sources of SR generation that regulate the activity of genes of redox-dependent proteins, in particular, MMP. Aim: to investigate the levels of CP in Mc of breast cancer cells and their influence on the activity of MMP-2 and -9 and metastasis. Object and methods: tumor tissue samples of 69 patients with breast cancer stage I–IV (Т1–4N0–2M0–1) aged from 31 to 75 years old were studied: 15 — І, 14 — ІІ, 13 — ІІІ, 27 — IV stages of the disease (including 17 — categories M1, 10 — M0). The superoxide-generating activity of blood neutrophils (N) was studied by electron paramagnetic resonance method on a computerized EPR-spectrometer RE-1307 using Spin Traps at room temperature (1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-oxypiperidine). The SR level in Mc of breast cancer cells was determined using a spin capture TEMPO-H. The activity of MMP-2 and -9 was determined by zymography polyacrylamide gels. Results: a direct correlation between the activity of MMP-2 and -9 and the rate of generation of SR Mc of breast cancer cells was detected (r = 0.61, r = 0.56, respectively, p < 0.05). It was found that after incubation of tumor cells with N that generated CP at 1.82 nmol/10⁵ cells ∙ min, for 6 h at t = 37 °C, the activity of MMP-2 and -9 was 1.43 ± 0.13 and 4.54 ± 0.19 CU and their latent forms — 1.88 ± 0.16 and 3.88 ± 0.12 CU, respectively. Incubation of tumor cells with N that generated SR with a rate of 4.31 nmol/10⁵ cells ∙ min resulted in a significant (2–3-fold increase) in the levels of active and latent forms of both enzymes. For BC stage I, the relatively small values of activity of MMP-2 and -9 are significantly higher mean values observed in patients with ІІ, ІІІ and, especially, in breast cancer stage IV without metastases. In patients with the category M1, decreased activity of MMP-2 and -9 in comparison with patients M0, respectively, in 4 and 2 times was determined. Conclusions: growth rate of SR generation in tumor cells and extracellular matrix is a critical and sufficient event for activation of MMP in tumors. In breast cancer SR, Mc and N are generated which infiltrate the primary tumor. The degree of induction by superoxide radicals MMP-2 and MMP-9 defines the malignant phenotype of tumors and their metastatic potential. The obtained results indicate the important role of redox regulation of MMP-2 and -9 activity in the stages of invasion and the formation of distant metastatic nodes.