Дiя iнгiбiторiв карбоангiдрази на ензиматичну активнiсть iзольованої тилакоїдної CF₁ АТФази

Abstract

Дослiджено дiю iнгiбiторiв карбоангiдрази — ацетазоламiду (АА) i етоксизоламiду (ЕА) на ферментативну активнiсть iзольованого чинника спряження CF₁ — каталiтичної частини АТФ-синтазного комплексу хлоропластiв. Фермент видiляли з хлоропластiв шпинату, обробляючи їх 1 мМ ЕДТА. Показано, що карбоангiдразна активнiсть CF₁, визначена в розчинi за прискоренням утворення CO₂ в реакцiї дегiдратацiї гiдрокарбонату, становить 73 мкмоль CO₂·(мг бiлка · хв)⁻¹ i майже в 30 разiв перевищує АТФазну активнiсть ферменту. АА i ЕА iнгiбують як АТФазну, так i карбоангiдразну актив нiсть CF₁. I₅₀ для Ca²⁺-АТФазної реакцiї, що каталiзується iзольованим CF₁у розчинi, становить 2 мкМ для АА i ЕА. АТФазна активнiсть дещо зростає при збiльшеннi концентрацiї ЕА. 50% iнгiбування карбоангiдразної активностi досягається за наявностi 2 мкМ АА i 12 мкМ ЕА. Зроблено висновок, що i водорозчинний АА, i жиророзчинний ЕА пригнiчують як АТФазну, так i карбоангiдразну активнiсть ферменту при близьких i вiдносно низьких концентрацiях. Функцiональна роль виявленої карбоангiдразної активностi може полягати в полегшеннi перенесення протонiв, якi поглинаються або видiляються в реакцiї синтезу або гiдролiзу АТФ вiдповiдно.

Изучено действие ингибиторов карбоангидразы — ацетазоламида (АА) и этоксизоламида (ЭА) на ферментативную активность изолированного сопрягающего фактора CF₁ — каталитической части АТФ-синтазного комплекса хлоропластов. Фермент выделяли из хлоропластов шпината, обрабатывая их 1 мМ ЭДТА. Показано, что карбоангидразная актив- ность CF₁, которую определяли в растворе по ускорению образования CO₂ в реакции дегидратации бикарбоната, составляет 73 мкмоль CO₂ · (мг белка · мин)⁻¹ и почти в 30 раз превосходит АТФазную активность фермента. АА и ЭА ингибируют как АТФазную, так и карбоангидразную активность CF₁. I₅₀ для Ca²⁺–АТФазной реакции, катализируемой изолированным CF₁ в растворе, составляет 2 мкМ для АА и ЭА. АТФазная активность несколько возрастает при увеличении концентрации ЭА. 50% ингибирование карбоангидразной активности достигается в присутствии 2 мкМ АА и 12 мкМ ЕА. Сделан вывод, что и водорастворимый АА, и жирорастворимый ЭА подавляют как АТФазную, так и карбоангидразную активность фермента при близких и относительно низких концентрациях. Функциональная роль обнаруженной карбоангидразной активности может состоять в облегчении переноса протонов, поглощающихся или выделяющихся в реакции синтеза или гидролиза АТФ соответственно.

We studied the effect of carbonic anhydrase inhibitors — acetazolamide (AA) and ethoxyzolamide (EA) — on the enzymatic activity of the isolated coupling factor CF₁ — a catalytic part of ATPsynthase complex of chloroplasts. The enzyme was isolated from spinach chloroplasts after their extraction with 1 mM EDTA. Carbonic anhydrase activity CF₁, which was determined in a solution by the acceleration of the formation of CO₂ in the bicarbonate dehydration reaction, was 73 μmol CO₂ · (min · mg protein)⁻¹ and almost 3 times more than the ATPase activity of the enzyme. Acetazolamide and ethoxyzolamide inhibit both the ATPase and carbonic anhydrase activities of CF₁. I₅₀ for Ca²⁺-ATPase reaction catalyzed by isolated CF₁ in solution was 2 μM for AA and EA. ATPase activity increased somewhat with the concentration of EA. 50% inhibition of the carbonic anhydrase activity was achieved in the presence of 2 μM AA and 12 μM EA, respectively. Thus, water-soluble AA and liposoluble EA inhibit both the ATPase and carbonic anhydrase enzyme activities at similar and relatively low concentrations. The functional role of the discovered carbonic anhydrase activity may consist in facilitating the transfer of protons uptaken or released in the reactions of ATP synthesis or hydrolysis, respectively.