Синтез афінних сорбентів для очищення аргі­на­зи і людини із рекомбінантних дріжджів Hansenula polymorpha

Abstract

Здійснено синтез афінних сорбентів із використанням мінеральних матриць: силохрому С-120 амінопропілового (розмір пор 50 нм), макропористого скла із контрольованим розміром пор (3680 нм) і силохромів С-80 та С-120 (65 та 44 нм). Для активації силохрому амінопропілового було використано глутаровий альдегід, для макропористого скла і силохромів С-80 та С-120 – γ-гліцидооксипропіл-три-етоксисилан. Активовані матриці було функціоналізовано L-аргініном. Порівняння різних афінних сорбентів показало, що аргінін-модифікований сорбент на основі макропористого скла з контрольованим розміром пор є оптимальним для виділення аргінази І печінки людини із безклітинних екстрактів рекомбінантних штамівнадпродуцентів, сконструйованих на основі дріжджів Hansenula polymorpha. Запропоновано спосіб виділення та очищення аргінази І людини, який дозволяє в одну стадію афінної колонкової хроматографії отримати з 11 %-ним виходом 200-кратно очищені (за питомою активністю) препарати фермента, гомогенні за результатами електрофоретичного аналізу в денатуруючому поліакриламідному гелі. Ключові слова: рекомбінантна аргіназа, афінний сорбент, макропористе скло, силохром, дріжджі Нansenula polymorpha.

The synthesis of affinity sorbents was performed using mineral matrixes: aminopropyl-silochrome C-120 (pore diameter – 50 nm), controlled pore glass (3680 nm), silochromes S-80 and S-120 (pore diameter – 65 and 44 nm). For activation of aminopropyl-silochrome and – glutaric aldehyde was used; for activation of controlled pore glass and silochromes – γ-glycidoxypropyltriethoxysilane was used. For functionlization of the sorbents, the L-arginine was coupled to the synthesized glycidyl- and aldehyde-containing matrixes. Comparison of different sorbents allowed to conclude that arginine-modified sorbent based on controlled pore glass, is optimal for isolation of human arginase I from the cell-free extracts of the recombinant yeast Hansenula polymorpha. One-step column affinity chromatography was developed and, as a result, a 200-fold purified preparation of recombinant arginase was obtained with 11% yield. The homogeneity of the arginase preparation was approved by PAAGE-SDS electrophoresis. Keywords: recombinant arginase, affinity sorbent, macroporous glass, silochrome, yeasts Hansenula polymorpha.

Осуществлен синтез аффинных сорбентов с использованием минеральных матриц: силохрому С- 120 аминопропилового (размер пор 50 нм), макропористого стекла с контролируемым размером пор (3680 нм) и силохромов С-80 и С-120 (65 и 44 нм). Для активации силохрома аминопропилового был использован глутаровый альдегид, для макропористого стекла и силохромов С-80 и С-120 - γ-глицидооксипропил-три-этоксисилан. Активированные матрицы были функционализированы L-аргинином. Сравнение различных аффинных сорбентов показало, что аргинин-модифицированный сорбент на основе макропористого стекла с контролируемым размером пор является оптимальным для выделения аргиназы І печени человека из бесклеточных экстрактов рекомбинантных штаммовнадпродуцентов, сконструированных на основе дрожжей Hansenula polymorpha. Предложен способ выделения и очистки аргиназы І человека, который позволяет в одну стадию аффинной колоночной хроматографии получить с 11%-ным выходом 200-кратно очищенные (по удельной активности) препараты фермента, гомогенные по результатам электрофоретического анализа в денатурирующем полиакриламидном геле. Ключевые слова: рекомбинантная аргиназа, аффинный сорбент, макропористое стекло, силохром, дрожжи Нansenula polymorpha.