Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена

Abstract

Метод биолистической трансформации был использован для генетического усовершенствования трех коммерческих сортов ячменя отечественной селекции (Оксамытовый, Водограй и Гетьман). Для трансформации использовали конструкцию pHLFTuBA, содержащую ген интереса, ген человеческого лактоферрина (hLF) под контролем глютелинового В-1 (GluB-1) промотора риса. В качестве селективного маркерного гена использовали ген мутантного a-тубулина, обеспечивающего устойчивость к трифлюралину (гербицид динитроанилинового ряда). Для установления селективной концентрации трифлюралина был проведен скрининг его разных концентраций в диапазоне от 0,1 до 30 мкМ. После 2–3 месяцев селекции на 10 мкМ трифлюралина были получены две трансгенные линии растений ячменя сорта Оксамытовый и каллусная линия сорта Гетьман. Для подтверждения стабильной интеграции гена hLF был проведен ПЦР-анализ листьев растений-регенерантов после их адаптации в грунте. В обеих линиях ячменя был амплифицирован фрагмент гена hLF размером 734 п.н.

Метод біолістичної трансформації використовували для генетичного вдосконалення трьох комерційних сортів ячменю вітчизняної селекції (Оксамитовий, Водограй і Гетьман). Для трансформації використовували конструкцію pHLFTuBA, що містила ген інтересу, ген людського лактоферину (hLF) під контролем глютелінового В 1 (GluB 1) промотору рису. Як селективний маркерний ген використовували ген мутантного α-тубуліну, що забезпечував стійкість до трифлюраліну (гербіцид динітроанілінового ряду). Для встановлення селективної концентрації агенту було проведено скринінг різних концентрацій трифлюраліну в діапазоні від 0,1 до 30 мкМ. Після 2–3 місяців селекції на 10 мкМ трифлюраліну було отримано дві трансгенні лінії рослин ячменю сорту Оксамитовий та калусну лінію сорту Гетьман. Для підтвердження стабільної інтеграції гена hLF було проведено ПЦР аналіз листків рослин-регенерантів після їх адаптації в грунті. В обох лініях було ампліфіковано фрагмент гена розміром 734 п.н.

Method of biolistic transformation was used for genetic improvement of commercial barley cultivars (Oksamitoviy, Vodogray and Getman). The plasmid pHLFTuBA was used for particle bombardment that consists of the hLF gene under the control of the barley glutelin B-1 promoter and a selectable marker gene, α-tubulin conferring resistance to trifluralin (dinitroanilinr herbicide). Preliminary screening of different trifluralin concentration range from 0,1 to 30 μM was tested for determination of effective selective agent concentration. Two transgenic barley line of genotype Oksamitiviy and transgenic callus line of cultivar Getman were obtained after selection on 10 μM of trifluralin. To confirm the transgenic nature of regenerated plants, the PCR analysis was carried out. The 734bp length fragment of hLF gene was amplified from both regenerated plants.