Просторова будова каліксарен-амінофосфонових кислот є суттєвою для прояву їхньої інгібуючої дії на Nа+, K+-ATP-азну активність у плазматичних мембранах гладеньком’язових клітин

Abstract

В експериментах, виконаних на суспензії плазматичних мембран клітин міометрія, оброблених 0,1%-м розчином дигітоніну, досліджували інгібуючу дію 5,17-ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-11,23-ди-трет-бутил-26,28-дигідрокси-25,27-дипропоксикалікс[4]арену (каліксарен С-107, наведено шифр) на Na+,K+-АТР-азну активність. Структуру цього та інших каліксаренів, а також їхніх попередників, підтверджено методами ядерного магнітного резонансу та інфрачервоної спектроскопії. Визначено, що каліксарен С-107, 10^-8 – 10^-4 М, дозозалежно пригнічує активність Na+,K+-АТР-ази, практично не впливаючи на активність базальної Mg^2+-АТР-ази. Величина уявної константи інгібування І0,5 становить 33 ± 4 нМ, значення коефіцієнта Хілла nH складає 0,38 ± 0,06. Модельні сполуки: незаміщений по верхньому вінцю 25,27-дипропоксикаліксарен (каліксарен С-150, суто каліксаренова «платформа», 10^-8 – 10^-4 М) та N-(4-гідроксифеніл)-2-піридил-амінофосфонова кислота (сполука М‑3, амінофосфонова група разом з фенольним фрагментом, 10^-6 – 4×10^-3 М) практично не впливають на досліджувані ензимні системи. 5,11-Ди(фосфоно-2-піридилметил)аміно-17,23-ди-трет-бутил-27,28-дигідрокси-25,26-дипропоксикалікс[4]арен (каліксарен С-160, регіоізомер каліксарену С-107, 10^-8 – 10^‑4 М) не впливає як на Na+,K+-АТР-азну, так і на Mg^2+-АТР-азну активність плазматичної мембрани клітин міометрія. З метою вивчення структурних особливостей каліксаренів С-107 і С-160 у зв’язку з дією останніх на АТР-гідролазну активність проведено молекулярне моделювання цих сполук з використанням програми HyperChem 7.01. При цьому виходили із того, що молекули каліксаренів є дицвітеріонами із протонованими амінними атомами азоту та двома депротонованими гідроксилами різних фосфонових фрагментів. При розрахунках здійснено конформаційний пошук оптимальної геометрії молекули (використовували метод молекулярної механіки – силове поле ММ+). Для кожного каліксарену відібрано 5 енергетично-мінімізованих конформерів. Загальні енергії цих структур також перерахували напівемпіричним методом (поле CNDO), після чого вибрали по одній структурі з найменшою загальною енергією. Згідно із розрахунками каліксарени С-107 і С-160 мають практично однаковий за конформацією регулярний конус. Разом з тим відстані N…N, С…С, Р…Р (l) між амінофосфоновими фрагментами N–C–P суттєво різняться. При цьому у дистально-заміщеному каліксарені С-107 обидві фосфонові групи орієнтовано усередину макроциклічної порожнини. У проксимальнозаміщеному каліксарені С-160 фосфонові групи орієнтовано на периферію. Молекулярна порожнина даного макроциклу заповнена одним із піридильних фрагментів. Дійшли висновку, що інгібуючий вплив каліксарену С-107 на Na+,K+-АТР-азну активність визначається взаємним розташуванням амінофосфонових груп саме у положеннях 5,17 на протилежних фенольних фрагментах верхнього вінця молекули каліксарену, на відміну від каліксарену С-160, для якого властива локалізація цих груп у положеннях 5,11. Із використанням методу лазерної кореляційної спектроскопії продемонстровано, що 100 мкМ каліксарен С-107, розчинений у 2,5%-му розчині ДМСО, містить мікрочастинки, які характеризуються різним гідродинамічним діаметром – від 100 нм до 10 мкм. У присутності фрагментів плазматичних мембран утворюється певна кількість частинок із розміром, більшим ніж 10 мкм, тобто за наявності каліксаренів відбувається аглютинація фрагментів біологічних мембран з мікрочастинками каліксарену та/або між собою. Отже, в цілому біофізико-хімічні ефекти у гетерогенній системі каліксарен-мембранні фрагменти є вельми складними. Проте для інгібувальної дії каліксарену С-107.

В экспериментах, выполненных на суспензии плазматических мембран клеток миометрия, обработанных 0,1%-м раствором дигитонина, исследовали ингибиторное действие 5,17-ди(фосфоно-2-пиридилметил)амино-11,23-ди-трет-бутил-26,28-ди-гидрокси-25,27-дипропоксикаликс[4]арена С-107 (указан шифр) на Na+,K+-АТР-азную активность. Этот каликсарен дозозависимо (10^-8 – 10^-4 М) угнетает активность Na+,K+-АТР-азы, практически невлияя на активность «базальной» Mg^2+-АТР-азы. Величина кажущейся константы ингибирования І0,5 составляет 33 ± 4 нМ, а значение коэффициента Хилла nH – 0,38 ± 0,06. Модельные соединения – незамещенный по верхнему ободу 25,27-дипропоксикаликсарен С-150 (10^-8 – 10^-4 М) – каликсареновая «платформа» и N-(4-гидроксифенил)-2-пиридил-аминофосфоновая кислота М-3 (1^0-8 – 4×10^-3 М) (аминофосфоновая группа вместе с фенольным фрагментом) – практически не влияют на исследованные энзиматические системы. 5,11-Ди(фосфоно-2-пиридилметил) амино-17,23-ди-трет-бутил-27,28-дигидрокси-25,26-дипропоксикаликс[4]арен С-160 – региоизомер каликсарена С-107 (10^-8–10^-4 М) не влияет как на Na+,K+-АТР-азную, так и на Mg^2+-АТР-азную активность плазматической мембраны клеток миометрия. Сделан вывод, что ингибирующее влияние каликсарена С-107 на Na+,K+-АТР-азу определяется взаимным расположением аминофосфоновых групп именно в положениях 5,17 на противоположных фенольных фрагментах верхнего венца молекулы каликсарена в отличие от каликсарена С-160, в котором эти группы локализованы в положении 5,11.

It was found that calixarene С-107 (5,17-diamino(2-pyridyl)methylphosphono-11,23-di-tret-butyl-26,28-dihydroxy-25,27-dipropoxycalix[4]arene) could effectively reduce Na+,K+-АТРase activity of the myometrium cell plasmatic membranes (the value of the apparent constant of inhibition I0.5 was 33 ± 4 nМ) while it practically did not influence the «basal» Mg^2+-АТРase activity of the same membrane. In comparative experiments, we have shown that the model calixarene C-150 – the calixarene «scaffold» (26,28-dihydroxy-25,27-dipropoxycalix[4]arene), and the model compound М-3 (4-hydroxyaniline(2-pyridine)methylphosphonic acid) – a fragment of the calixarene С-107, had practically no influence on the enzymatic activities of Na+,K+-АТРase and Mg^2+-АТРаse over a wide range of concentrations. Hence, the influence of calixarene С-107 on Na+,K+-АТРase activity was caused by the joint action of two aminophosphonic substituents on the upper rim of the calixarene bowl. The isomer of calixarene С-107 – calixarene С‑ 160 (5,11-diamino(2-pyridyl)methylphosphono-17,23-di-tret-butyl-26,28-dihydroxy-25,27-dipropoxycalix[4]arene) also did not influence the Na+,K+-АТРase and Mg^2+-АТРаse activities of plasmatic membrane of myometrium cells. We carried out molecular modeling of calixarenes C-107 and C-160 and showed differences in interatomic distance between aminophosphonic substituents of mentioned calixarenes. We came to the conclusion that spatial structure of calixarene С-107, namely localization of two aminophosphonic substituents in 5,17 position of the upper rim of this calixarene, is crucial for inhibition of Na+,K+-АТРase activity. Using laser correlation spectroscopy it was found that the 100 μM solution of calixarene C-107 and 2.5% DMSO had microparticles with size range from 100 nm to 10 μm. Plasma membrane vesicles had average hydrodynamic diameter 401 ± 17 nm, but after interaction of these vesicles with calixarene C-107 we have registered the creation of some particles with sizes greater than 10 μm. Therefore membrane vesicles agglutinated to each other and/or to calixarene microparticles.