Плазмідний вектор для доставки гена препроінсуліну людини в клітини ссавців

Abstract

Сконструйовано еукаріотний вектор експресії гена препроінсуліну людини для подальшої доставки у неендокринні клітини ссавців in vitro та in vivo з метою розробки експериментальної генної терапії діабету 1-го типу. Векторна конструкція складається з двох незалежних модулів: послідовності бактеріальної плазміди, шр дозволяє їй реплікуватися у клітинах Escherihia coli, і експресійної касети з цільовим та маркерним генами, фланкованої інвертованими термінальними повторами аденоасоційованого вирусу людини. Для забезпечення конститутивної експресії гена препроінсуліну використано промотор ранніх генів цитомегаловірусу людини. Для посилення експресії цільового трансгена у вектор субклонували енхансер 1 вірусу гепатиту В. Після перенесення in vitro векторної конструкції у клітини ссавців різного походження одержано стабільні трансформанти і ПЛР-аналізом підтверджено наявність цільового трансгена пре­проінсуліну людини у трансформованих клітинах.

Eukaryotic expression vector for human preproinsuiin gene has been constructed for further delivery into non-endocrine mammalian cells in vitro and in vivo for the development of experimental gene therapy for type I diabetes. Vector construction consists of two independent modules, namely, bacterial plasmid sequence that allows its replication in Escherichia coli cells, and expression cassette for the target and marker genes which is flanked by inverted terminal repeats of human adeno-associated virus. The human cytomegalovirus immediate-early promoter has been used to ensure the constitutive expression of human preproinsuiin gene. The hepatitis B viral enhancer 1 was subcloned into cassette to increase the target transgene expression. After vector construction in vitro transfer into mammalian cells of different origin, the stable transformants were obtained and the availability of target human preproinsuiin transgene in the transformed cells has been confirmed by PCR analysis.

Сконструирован эукариотный вектор экспрессии гена препро­инсулина человека для последующей доставки в неэндокринные клетки млекопитающих in vitro и in vivo с целью разработки экспериментальной генной терапии диабета 1-го типа. Векторная конструкция состоит из двух независимых модулей: последовательности бактериальной плазмиды, которая позво­ляет ей реплицироваться в клетках Escherihia coli, и экспрессионной кассеты с целевым и маркерным генами, фланкиро­ванной инвертированными терминальными повторами адено-ассоциированного вируса человека. Для обеспечения конститу­тивной экспрессии гена препроинсулина использовали промо­тор ранних генов цитомегаловируса человека. Для усиления экспрессии целевого трансгена в вектор субклонировали энхансер 1 вируса гепатита В. После переноса in vitro векторной конструкции в клетки млекопитающих разного происхожде­ния получены стабильные трансформанты и ПЦР-анализом подтверджена наличие целевого трансгена препроинсулина че­ловека в трансформированных клетках.