Дослідження взаємодії ізольованого С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії

Abstract

Не каталітичний С-модуль тирозил-тРНК синтетази ссавців має подвійну функцію: бере участь у зв' язуванні тРНК як цис-фактор та після протеолітичного відщеплення від каталітичного кора синтетази проявляє иитокінову активність подібно до цитокіну ЕМАР II. С-модуль TyrRS містить залишок триптофану Trp144, який є флуоресцентним зондом у структурі білка, однак локалізований поза сайтом зв'язування РНК. Для дослідження взаємодії ізольованого С-модуля з тРНК консервативний ароматичний залишок (Phe) 127 у РНК-зв' язу вальному центрі методами сайт-спрямованого мутагенезу було замінено на флуорофор Trp127. Це дозволило суттєво підвищити квантовий вихід флуоресценції білка та визначити параметри зв'язування С-модуля з тРНК. На основі даних спектрофлуориметричного титрування визначено величину константи дисоціації комплексу С-модуля з тPHK (Phe), яка складає 2,9-10⁻⁸ М, та стехіометрію комплексу (n = 1,2).

The non-catalytic COOH-terminal module of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase manifests a dual function: involvement in tRNA binding as a cis-factor and cytokine activity after proteolytic cleavage from synthetase catalytic core similar to EMAP II cytokine. The C-module of TyrRS contains a single Trp144 which is an intrinsic fluorescent probe in protein structure, but it is localized outside of RNA binding site. To explore the interaction between C-module and tRNA in solution the conservative aromatic (Phe) 127 residue was substituted for Trp127 fluorophore by site-directed mutagenesis. This replacement allowed enhancing the protein quantum yield and determining the binding parameters of tRNA and C-module. The dissociation constant of the complex between C-module and tRNA (Phe) was calculated on the basis of spectrofluorometric titrations data. It was about 2,9-10⁻⁸ M, and stoichiometry of the complex n=1.2.

Некаталитический С-модуль тирозил-тРНК синтетазы мле­копитающих выполняет двойную функцию: участвует в свя­зывании тРНК как цис-фактор и при протеолитическом расщеплении от каталитического кора синтетазы проявляет цитокиновую активность подобно цитокину ЕМАР II. С-мо­дуль TyrRS содержит остаток триптофана Trp144, который является флуоресцентним зондом в структуре белка, однако локализован вне сайта связывания РНК. Для исследования взаимодействия изолированного С-модуля с тРНК консерва­тивный ароматический остаток (Phe) 127 в РНК-связывающем центре был заменен на флуорофор Trp127 методами сайт-на­правленного мутагенеза. Это позволило существенно повы­сить квантовый выход флуоресценции белка и определить параметры связывания С-модуля с тРНК. На основе данных спектрофлуориметрического титрования определены величи­на константы диссоциации комплекса С-модуля с тPHK (Phe), которая составляет 2,9-10⁻⁸ М, и стехиометрия комплекса (n = 1,2).