Роль вищерозташованого стимулюючого фактора 2а в регуляції експреси шгюітора активатора плазміногена-1

Abstract

Експресія інгібітори активатора плазміногена-1 (ІАП-1) стимулюється гіпоксією (8 % О2). За цю стимуляцію відповідає ділянка в промоторі IAП-1 (-175/-159), яка містить елемент, що сприймає гіпоксію (ЕСГ-2). З останнім взаємодіє фактор 1, що його стимулює гіпоксія (ФСГ-1). З ділянкою ЕСГ-2 межує ділянка ЕСГ-1, з якою зв'язується раніше не ідентифікований фактор. У даній роботі зроблено спробу ідентифікувати цей фактор і з'ясувати його роль у регуляції експресії ІАП-1. На підставі зсуву специфічної електрофоретичної смуги доведено, що з сайтами ЕСГ, переважно з ЕСГ-1, зв'язується вищерозташований стимулюючий фактор-2а (ВСФ-2а). В первинній культурі гепатоцитів щура надекспресія ВСФ-2а в однаковій мірі пригнічувала експре­сію ІАП-1-специфічної мРНК та білка ІАП-1 за умов як гіпоксії, так і нормоксії. Первинні гепатоцити щура трансфікували двома рекомбінантними ДНК – конструкцією з геном люциферази під контролем ділянки промотору ІАП-1 довжиною 766 або 276 п. о. і векторами, які експресують ВСФ дикого (ВСФ-2а) або мутантного (ΔВСФ-2а) типу. Останній не виявляє ДНК-зв'язуючої та димеризуючої активностей. Котрансфекція з вектором, який експресує ВСФ-2а, пригнічувала активність люциферази у 8 разів порівняно з контролем, де білок ВСФ-2а був відсутнім. Котрансфекція з вектором, який експресує ΔВСФ-2а, не впливала на люциферазну активність. Мутації обох ЕСГ (і в більшій мірі мутація ЕСГ-1) перешкоджали пригніченню контрольованої промотором ІАП-1 люциферазної активності. Інгібіторної дії ВСФ-2а, опосеред­кованої ЕСГ-2, на відміну від ЕСГ-1, не спостерігалося при надекспресії ФСГ-la. Ці результати свідчать про те, що баланс між двома транскрипційними факторами, ВСФ-2а та ФСГ-1 а, що можуть зв'язуватися з суміжними ЕСГ, відіграє певну роль у регуляції експресії ІАП-1 за умов гіпо- та нормоксії.

The plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) expression is induced by mild hypoxia (8 % O2) via the PAI-1 promoter region -175/-159 containing a hypoxia response element (HRE-2) binding the hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) and an adjacent response element (HRE-1) binding a so far unknown factor. The aim of the present study was to identify this factor and to investigate its role in the regulation of PAI-1 expression. It was found by supershift assays that the upstream stimulatory factor-2a (USF-2a) is bound mainly to HRE-1 of the PAI-1 promoter and to a lesser extent to HRE-2. The USF-2a overexpression inhibited both PAI-1 mRNA and protein expression in primary cultured rat hepatocytes under normoxia and hypoxia. The Luciferase (Luc) reporter gene constructions driven by 766 and 276 bp of the 5'-flanking region of the rat PAI-1 gene were transiently transfected into primary rat hepatocytes together with the expression vectors encoding a wild type USF-2a and a USF-2a mutant lacking DNA-binding and dimerization activity (ΔHU2a). The cotransfection of the wild type USF-2a vector reduced the Luc activity by about 8 fold, whereas the cotransfection of ΔHU2a did not influence this activity. Mutation of the HRE-1 (-175/-168) in the rat PAI-1 promoter Luc constractions decreased the VSF-dependent inhibition of the Luc activity. Mutation of the HRE-2 (-165/-158) was less effective. These results indicated that the balance between two transcriptional factors, HIF-I and USF-2a, which could bind adjacent the HRE sites, appeared to be involved in the regulation of the PAI-1 expression under many clinical conditions.

Экспрессия ингибитора активатора плазминогена-1 (ИАП-1) стимулируется гипоксией (8 % О2) За эту стимуляцию отвечает участок в промоторе ИАП-1 (-175/-159), содержа­щий элемент, воспринимающий гипоксию (ЭВГ-2). С послед­ним взаимодействует фактор 1, стимулируемый гипоксией (ФСГ-1). С участком ЭВГ-2 граничит область ЭВГ-1, с которой связывается ранее не идентифицированный фактор. В данной работе осуществлена попытка идентифицировать этот фактор и выяснить его роль в регуляции экспрессии ИАП-1. На основании сдвига специфической электрофоретической полосы доказано, что с сайтами ЭВГ, преимущественно с ЭВГ-1, связывается вышерасположенный стимулирующий фактор-2а, ВСФ-2а. В первичной культуре гепатоцитов кры­сы суперэкспрессия ВСФ-2а в одинаковой мере угнетала экспрессию ИАП-1-специфической мРНК и белка ИАП-1 в услови­ях как гипоксии, так и нормоксии. Первичные гепатоциты крысы трансфицировали двумя рекомбинантными ДНК – кон­струкцией с геном люциферази под контролем участка промо­тора ИАП-1 длиной 766 или 276 п. о. и векторами, экспрессирующими ВСФ дикого (ВСФ-2а) или мутантного (ΔВСФ-2а) типа. Последний не выявляет ДНК-связывающей и димеризационной активностей. Котрансфекция с вектором, экспрессирующим ВСФ-2а, угнетала активность люциферазы в 8 раз по отношению к контролю, где белок ВСФ-2а отсутствовал Котрансфекция с вектором, экспрессирующим ΔВСФ-2а, не влияла на люциферазную активность. Мутации обоих ЭВГ и в большей мере мутация ЭВГ-1 препятствовали угнетению контролированной промотором ИАП-1 люциферазной актив­ности. Ингибитор ного действия ВСФ-2а, опосредованного ЭВГ-2, в отличие от ЭВГ-1, не наблюдалось при суперэкспрес­сии ФСГ-la. Эти результаты свидетельствуют о том, что баланс между двумя транскрипционными факторами, ВСФ-2а и ФСГ-la, способными связываться со смежными ЭВГ, играет определенную роль в регуляции экспрессии ИАП-1 в условиях гипо- и нормоксии.