Biological properties of neural crest-derived multipotent stem cells from the bulge region of whisker follicle expanded in new culture conditions

Abstract

Aim. The work is aimed at obtaining the culture of neural crest-derived multipotent stem cells (NC-MSCs) in new culture conditions and to investigate their biological properties. Methods. NC-MSCs were grown from the explants of the bulge region of whisker follicle of adult mice. The cell cultures were examined by the following methods: sphere-forming assay, directed multilineage differentiation, CFU assay, immunocytochemistry, flow cytometry, RT-PCR. Results. The obtained NC-MSCs expressed the typical neural crest markers (nestin, Sox10 and Sox2) and were differentiated into adipocytes, osteoblasts and Schwann cells. Under our original growing conditions, the culture of NC-MSCs at the third passage had the following parameters: 66.8 % nestin+, 3.1 % ALDH brigth and 33.3 % clonogenic cells. The NC-MSCs growth rate depended on plating density. EGF and bFGF demonstrated a dose-dependent mitogenic action on NC-MSCs. Conclusions. The proposed approach permits the NC-MSC expansion with the maintenance of their main functional properties. Further optimization of the culture conditions will be based on the use of growth factors and low plating density.

Мета. Отримати культуру мультипотентних стовбурових клітин – похідних нервового гребеня (МСК-ПНГ) за нових умов культивування та дослідити їхні біологічні властивості. Методи. МСК-ПНГ отримували з експлантів бульбарного району волосяного фолікула вібриса дорослих мишей. Культури клітин вивчали з використанням наступних методів: дослідження на здатність до сфероутворення, направлене мультилінійне диференціювання, тест на колонієутворювальну здатність, імуноцитохімія, проточна цитометрія, ЗТ-ПЛР. Результати. Отримані МСК-ПНГ експресували характерні для нервового гребеня маркери (нестин, Sox10 и Sox2) та диференціювалися в адипоцити, остеобласти та Шванівські клітини. У запропонованих нами умовах культура МСК-ПНГ на третьому пасажі містила: 66,8 % нестину+, 3,1 % ALDHbrigth и 33,3 % колонієутворювальних клітин. Встановлено, що швидкість росту МСК-ПНГ залежить від щільності посіву. Виявлено дозозалежну мітогенну дію EGF і bFGF на МСК-ПНГ. Висновки. Розроблено новий підхід, що дозволяє нарощувати МСК-ПНГ із збереженням їхніх основних функціональних властивостей. Подальша оптимізація умов культивування буде заснована на використанні факторів росту і низької щільності посіву.

Цель. Получить культуру мультипотентных стволовых клеток – производных нервного гребня (МСК-ПНГ) в новых культуральных условиях и исследовать их биологические свойства. Методы. МСК-ПНГ получали из эксплантов бульбарного района волосяного фолликула вибрисса взрослых мышей. Культуры клеток изучали следующими методами: исследование на способность к сферогенезу, направленная мультилинейная дифференциация, тест на колониеобразующую способность, иммуноцитохимия, проточная цитометрия, ОТ-ПЦР. Результаты. Полученные МСК-ПНГ экспрессировали характерные маркеры нервного гребня (нестин, Sox10 и Sox2) и дифференцировались в адипоциты, остеобласты и Шванновские клетки. В предложенных нами условиях культура МСК-ПНГ на третьем пассаже содержала: 66,8 % нестина+, 3,1 % ALDHbrigth и 33,3 % колониеобразующих клеток. Определено, что скорость роста МСК-ПНГ зависит от плотности посева. Показано дозозависимое митогенное действие EGF и bFGF на МСК-ПНГ. Выводы. Предложен подход, позволяющий наращивать МСК-ПНГ с сохранением их основных функциональных свойств. Дальнейшая оптимизация условий культивирования будет основана на использовании факторов роста и низкой плотности посева.