Unrepairable substrates of nucleotide excision repair and their application to suppress the activity of this repair system

Abstract

In the previous studies, the DNA with the bulky Fap-dC derivative was demonstrated to be a difficult substrate for the nucleotide excision repair (NER), a system which is involved in the removal of bulky lesions from DNA. This type of compounds could be of particular interest as possible selective NER, considerably reducing the potency of DNA repair due to competitive immobilization of protein factors involved in this process. This approach can be potentially useful to increase the efficiency of chemotherapy. Aim. To identify DNA structures containing multiple bulky adducts that can efficiently inhibit the nucleotide excision repair. Methods. Enzymatic DNA synthesis, PCR, NER-competent cell extract preparation, in vitro NER assay, HPLC. Results. The conditions for the synthesis of extended DNA containing multiple unrepairable lesions were established. A wide range of DNA structures containing modified nucleotides was obtained. All modified DNAs were shown to inhibit the in vitro activity of the NER system. The DNA structure that inhibits the NER activity with the highest efficiency was selected. Conclusions. The model DNA structures effectively inhibiting the activity of NER were found. The new data obtained here can potentially be used for both basic and applied research.

У наших попередніх дослідженнях було показано, що ДНК з об'ємним похідним Fap-dC є складнорепарованим субстратом для системи ексцизійної репарації нуклеотидів (Ерн). З'єднання такого типу можуть становити особливий інтерес як можливі селективні інгібітори системи Ерн, значно знижуючи ефективність репарації ДНК шляхом зв'язування білкових чинників, залучених до даного процесу. Цей підхід може бути потенційно корисний для підвищення ефективності хіміотерапії. Мета. Дане дослідження спрямоване на пошук ДНК-структур, що містять множинні об'ємні аддукти, які з найбільшою ефективністю можуть пригнічувати активність системи. Методи. Ферментативний синтез ДНК, ПЛР, приготування Ерн-компетентних клітинних екстрактів, реакція вирізання, що каталізується білками Ерн in vitro, ВЕРХ. Результати. Проведено підбір умов синтезу протяжних модельних ДНК з множинним включенням нерепарованого пошкодження Fap-dC. Отримано ряд ДНК-структур, що містить в своєму складі різну кількість модифікованих ланок. Показано, що всі отримані ДНК пригнічують активність системи Ерн in vitro. Обрана ДНК-структура, яка пригнічує NER найбільш високою ефективністю. Висновки. Модельні ДНК з нерепарованими ушкодженнями, здатні високою ефективністю пригнічувати NER, можуть розглядатися в якості інгібіторів системи Ерн. Виявлені в даній роботі закономірності потенційно можуть бути використані для проведення як фундаментальних, так і прикладних досліджень.

В наших предыдущих исследованиях было показано, что ДНК с объемным производным Fap-dC является труднорепарируемым субстратом для системы эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН). Соединения такого типа могут представлять особый интерес как возможные селективные ингибиторы системы ЭРН, значительно снижая эффективность репарации ДНК путем связывания белковых факторов, вовлеченных в этот процесс. Этот подход может быть потенциально полезен для повышения эффективности химиотерапии. Цель.Текущее исследование направлено на поиск ДНК-структур, содержащих множественные объемные аддукты, которые с наибольшей эффективностью могут подавлять активность системы. Методы. Ферментативный синтез ДНК, ПЦР, приготовление ЭРН-компетентных клеточных экстрактов, реакция вырезания, катализируемая белками ЭРН in vitro, ВЭЖХ. Результаты. Проведен подбор условий синтеза протяженных модельных ДНК с множественным включением нерепарируемого повреждения Fap-dC. Получен ряд ДНК-структур, содержащий в своем составе различное количество модифицированных звеньев. Показано, что все полученные ДНК подавляют активность системы ЭРН in vitro. Выбрана ДНК-структура, которая ингибирует NER наиболее высокой эффективностью. Выводы. Модельные ДНК с нерепарируемыми повреждениями, способные высокой эффективностью подавлять NER, могут рассматриваться в качестве ингибиторов системы ЭРН. Обнаруженные в настоящей работе закономерности потенциально могут быть использованы для проведения не только фундаментальных, но и прикладных исследований.