A dual-target strategy for the detection of Chlamydia trachomatis by real-time PCR

Abstract

Aim. Polymerase chain reaction (PCR) is a key method for the C. trachomatis diagnostics. The first-generation tests targeting a cryptic plasmid showed quite a high sensitivity; however their value has recently been compromised by the discovery of C. trachomatis strains lacking the target DNA segment (e.g. the “Swedish” variant) and thus escaping the diagnostics. Moreover, there are variants bearing no plasmid at all. We propose the addition of a chromosome gene as a PCR tar-get to back up plasmid-based assays and enhance the overall efficiency of diagnostics. Methods. Two multiplexed PCRs were set up to target C. trachomatis cryptic plasmid and the 16s rRNA gene. The 16s rRNA primers produce PCR signal from a range of Chlamydia species whereas the introduction of a Taqman probe (essential for real-time PCR) scales the assay down to C. tra-chomatis. At the same time, our plasmid PCR is specific to C. trachomatis exclusively. Results. The sensitivity of plasmid and 16s rRNA PCRs reached from one to ten genome-equivalents per reaction (geq/rxn) whereas the efficiency was always about 100%. Multiplexing did not reduce the analytical sensitivity. Addition of DNA prepared from clinical specimens to the reaction mix did not affect PCR with pure C. trachomatis DNA further demonstrating the robustness of this system. The kinetics of the two reactions was compared in 49 DNA samples prepared from C. trachomatis-positive swabs. In 45 of these samples, the reactions showed a good correlation in the threshold cycle of amplification Cq, the main analytical parameter of real-time PCR. Conclusions. The simultaneous detection of chromosomal and plasmid targets in multiplex PCR offers a high sensitivity and is particularly advantageous for specimens where the plasmid might be lost due to DNA degradation or counter-selection after treatment. The dual strategy of PCR presented here could constitute the core of a diagnostic test for both in-house and commercial use.

Мета. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) є ключовим методом діагностики C. trachomatis. Мішенню тестів першого покоління є криптична плазміда, що забезпечує досить високу чутливість. Однак придатність цих тестів була поставлена під сумнів після відкриття штамів, в яких був відсутній цільовий сегмент ДНК, і такі варіанти не виявлялись у ПЛР (т.з. «шведські» варіанти). Більш того, існують варіанти, повністю позбавлені плазміди. У цій роботі ми пропонуємо використовувати хромосомний ген в якості додаткової мішені, що дозволить підстрахувати плазмідні ПЛР-тести і може підвисити загальну ефективність діагностики. Методи. Мультиплексна система із двох ПЛР була укладена для одночасної детекції криптичної плазміди і фрагменту гена 16s рРНК. Праймери на 16s рРНК можуть давати сигнал ПЛР при аналізі низки видів Chlamydia. Додання зонду типу Taqman (необхідного для ПЛР у реальному часі) звужує спектр виявлюваних видів до C. trachomatis. В той же час ПЛР з плазміди є специ-фічною виключно до C. trachomatis. Результати. Чутливість ПЛР з плазміди і гену 16s рРНК сягала від 1 до 10 ге-ном-еквівалентів на реакцію, а ефективність ПЛР була близько 100%. Постановка реакцій в мультиплексі не зме-ншувало аналітичну чутливість. Додання реакційної суміші ДНК, приготованої із клінічних зразків, не впливало на ПЛР з чистої ДНК C. trachomatis, що також демонструє надійність системи. Кінетика цих двох реакцій була порів-няна в 49 зразках ДНК із мазків позитивних по C. trachomatis. В 45 із цих зразків реакції показали добру кореляцію порогових циклів ампліфікації Cq – основного аналітичного параметра ПЛР у реальному часі. Висновки. Одночас-на детекція хромосомної та плазмідної мішеней у мультиплексній ПЛР забезпечує високу чутливість і має особли-ві переваги для зразків, де плазміда може бути втрачена в результаті деградації ДНК чи контр-селекції при терапії. Двоцільова стратегія ПЛР, яка представлена в цій роботі, може бути покладена в основу ефективного внутрішньо-лабораторного чи комерційного діагностичного тесту.

Цель. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является ключевым методом диагностики C. trachomatis. Мишенью тестов первого поколения является криптическая плазмида, что обеспечивает достаточно высокую чувствитель-ность. Однако адекватность этих тестов была поставлена под сомнение после открытия штаммов, где отсутствовал целевой сегмент ДНК, и такие варианты не выявлялись в ПЦР (т.н. «шведские» варианты). Более того, существуют варианты, полностью лишенные плазмиды. В этой работе, мы предлагаем использовать хромосомный ген в качес-тве дополнительной мишени, что позволит подстраховать плазмидный ПЦР-тест и может повысить общую эффек-тивность диагностики. Методы. Мультиплексная система из двух ПЦР была составлена для одновременной детек-ции криптической плазмиды и фрагмента гена 16s рРНК. Праймери на 16s рРНК могут давать сигнал ПЦР при анализе ряда видов Chlamydia. Добавление зонда типа Taqman (необходимого для ПЦР в реальном времени) сужа-ет спектр виявляемых видов до C. trachomatis. В то же время, ПЦР с плазмиды обладает специфичностью исклю-чительно к C. trachomatis. Результати. Чувствительность ПЦР с плазмиды и гена 16s рРНК достигала от 1 до 10 геном-еквивалентов на реакцию, а эффективность ПЦР была около 100%. Постановка реакций в мультиплексе не уменшало аналитическую чувствительность. Добавление к реакционнной смеси ДНК, приготовленной из клини-ческих образцов, не влияло на ПЦР с чистой ДНК C. trachomatis, что также демонстрирует надежность системы. Кинетика этих двух реакций была проанализирована в сравнении на 49 образцах ДНК из мазков, позитивных по C. trachomatis. В 45 из этих образцов реакции показали хорошую корреляцию порогових циклов амплификации Cq – основного аналитического параметра ПЦР в реальном времени. Выводы. Одновременная детекция хромосомной и плазмидной мишеней в мультиплексной ПЦР обеспечивает высокую чувствительность и имеет особенное пре-имущество при анализе образцов, где плазмида может быть утрачена в результате деградации ДНК или контр-селекции при терапии. Двух-целевая стратегия ПЦР, представленная в данной работе, может быть положена в ос-нову эффективного внутрилабораторного или коммерческого диагностичного теста.