Роль нуклеотидов в позициях 1 и 72 акцепторного стебля тРНКTyr в аминоацилировании тирозил-тРНК синтетазой из печени быка

Abstract

Для выяснения вклада каждого из нуклеотидов первой пары акцепторного стебля в тождествен­ность тРНКТуг быка получены тРНКTyr-транскрипты, мутантные по позициям 1 и 72. Опреде­лены кинетические параметры реакции аминоацилирования мутантных транскриптов рекомбинантной тирозил-тРНК синтетазой из печени быка. Показано, что транскрипт, имеющий первую пару акцепторного стебля G1-G72, характеризуется такой же каталитической эффек­тивностью тирозилирования, как и транскрипт дикого типа с первой парой акцепторного стебля C1-G72. Цитозин в позиции 72 полностью блокирует аминоацилирование транскрипта независимо от того, гуанозин или цитозин находится в первой позиции. Нуклеотидные замены G72A и G72U также снижают акцепторную активность транскрипта, однако в меньшей степени, чем замена G72C. При этом зависимость акцепторной активности транскрипта от нуклеотида в позиции 1 остается слабой. Сделано заключение о том, что вклад первой пары акцепторного стебля в тождественность тРНКTyr быка связан, главным образом, с гуанозином-72.

Для з'ясування внеску кожного з нуклеотидів першої пари акцепторного стебла в тотожність тРНКTyr бика отримано тРНКTyr -транскрипти, мутантні по позиціях 1 и 72. Визна­чено кинетичні параметри реакції аминоацилювання мутант­них транскриптів рекомбинантною тирозил-тРНК синтета­зою печінки бика. Показано, що транскрипт з першою парою акцепторного стебла G1-G72 характеризується такою ж каталітичною ефективністю тирозилювання, що й транс­крипт дикого типу з першою парою акцепторного стебла C1-G72. Цитозин у позиції 72 повністю блокує аміноацилювання транскрипту незалежно від того, гуанозин чи цито­зин знаходиться в першій позиції. Нуклеотидні заміни G72A та G72U також знижують акиепторну активність транскрипту, однак у меньшій мірі, ніж заміна G72C. При цьому залежність акцепторное активності від нуклеотиду в позиції 1 транскрипта залишається слабкою. Зроблено висновок, що внесок першої пары акцепторного стебла в тотожність тРНК у бика пов'язаний, головним чином, з гуанозином-72.

In order to investigate the contribution of each nudeotide of the first base-pare of bovine tRNATyr acceptor stem in tyrosine identity the set of mutant in vitro transcripts were prepared. Kinetic parameters of the tyrosylation for each transcript were determined using recombinant bovine tyrosyl-tRNA synthetase overproduced in bacterial system and purified by means of C-terminal 6xHis tag. It was found that transcript with first pair G1-G72 shows nearly the same catalytic efficiency as wild-type transcript CJ-G72, whereas C in position 72 completely abolishes tyrosylation regardless of C or G located in 1st position. A or U in position 72 decrease acceptor activity to a lesser extent, with U72 having the more evident effect, also with weak dependence on nudeotide in 1st position. Basing on this results we suggest that contribution of the first base-pair to bovine tRNATyr identity rely mainly on the guanosine in position 72.