Ku80 interaction with apurinic/apyrimidinic sites depends on the structure of DNA ends

Abstract

Aim. The identification of a protein from human cell extract which specifically interacts with the apurinic/apyrimidinic (AP) site in the partial DNA duplex containing 5'and 3'-dangling ends (DDE-AP DNA) and mimicking clustered DNA damage. Methods. The Schiff base-dependent cross-linking of a protein to AP DNA (borohydride trapping), MALDI-TOF-MS, chromatography, and gel electrophoresis. Results. A human cell extract protein which forms a major covalent adduct with the AP DNA duplex with dangling ends was identified as the Ku80 subunit of Ku antigen by peptide mass mapping based on MALDI-TOF-MS data. The Ku antigen purified from the HeLa cell extract was shown to form the covalent adducts with the same mobility as observed in cell extracts. Conclusions. The Ku80 subunit of Ku antigen can specifically interact with AP DNA forming the Schiff base-mediated adducts which electrophoretic mobility depends on the structure of DNA ends. The difference in electrophoretic mobility can be caused by the cross-linking of AP DNA to distinct target amino acids that appears to reflect unequal positioning of AP DNAs in the complex with Ku antigen.

Мета. Ідентифікація білка з екстракту клітин людини, який специфічно взаємодіє з апуриновим/апіримідиновим (AP) сайтом у складі часткового дуплексу ДНК, що містить виступаючі 5'і 3'-кінці та імітує кластерне пошкодження ДНК. Методы. Зшивання білка з AP-ДНК, опосередковане утворенням основи Шиффа, MALDI-TOF мас-спектрометрія, хроматографія і гель-електрофорез. Результаты. Білок клітинних екстрактів людиниа, який формує мажорний ковалентний адукт з AP-ДНК, що містить виступаючі кінці, ідентифіковано як субодиниця Ku80 Ku-антигену методом пептидного картування, заснованого на даних MALDITOF мас-спектрометрії. Показано, що Ku-антиген, виділений з клітин HeLa, формує ковалентні адукти, електрофоретична рухливість яких відповідає рухливості адуктів, утворених білками з клітинних екстрактів. Висновки. Субодиниця Ku80 Ku-антигену може специфічно взаємодіяти з AP-ДНК, формуючи адукти, опосередковані утворенням основи Шиффа, електрофоретична рухливість яких залежить від структури кінців ДНК. Розбіжності в електрофоретичній рухливості можуть обумовлюватися зшиванням AP-ДНК з різними амінокислотними залишками білка, що в свою чергу може відображати різне розташування АP-ДНК у комплексі з Ku-антигеном.

Цель. Идентификация белка клеточных экстрактов человека, специфично взаимодействующего с апуриновым/апиримидиновым (AP) сайтом в составе частичного ДНК-дуплекса, содержащего выступающие 5'и 3'-концы и имитирующего кластерное повреждение ДНК. Методы. Сшивка белка с AP-ДНК, опосредованная образованием основания Шиффа, MALDI-TOF масс-спектрометрия, хроматография и гель-электрофорез. Результаты. Белок клеточных экстрактов человека, формирующий мажорный ковалентный аддукт с AP-ДНК, содержащей выступающие концы, идентифицирован как субъединица Ku80 Ku-антигена методом пептидного картирования, основанного на данных MALDI-TOF массспектрометрии. Показано, что Ku-антиген, выделенный из клеток HeLa, формирует ковалентные аддукты, электрофоретическая подвижность которых соответствует подвижности аддуктов, формируемых белками клеточных экстрактов. Выводы. Субъединица Ku80 Ku-антигена может специфично взаимодействовать с AP-ДНК, формируя аддукты, опосредованные образованием основания Шиффа, электрофоретическая подвижность которых зависит от структуры концов ДНК. Различие в электрофоретической подвижности может быть обусловлено сшивкой AP-ДНК с разными аминокислотными остатками белка, что может отражать различное расположение AP-ДНК в комплексе с Ku-антигеном.