Generation of HEK-293 stable cell lines with disrupted expression of ribosomal protein S6 kinase (S6K1) isoforms using the CRISPR/Cas9 genome editing system

Abstract

Aim. To generate HEK-293 cells with disrupted expression of S6K1 isoforms: p85, p70 and p60. Methods. CRISPR/Cas9 gene editing, Western blotting, immunofluorescent analysis, RT-PCR analysis, MTT assay, scratch assay. Results. Several clones of HEK-293 cells with a complete loss of p85/p70/p60-S6K1 protein expression were generated. The effects of p85/p70/p60-S6K1 knockout on Akt/mTORC1/S6K1 signaling and cell proliferation and migration were assessed. Conclusions. The generated cell lines can be used to study a role played by S6K1 in cell physiology and to gain more detailed insight into cellular functions of the S6K1 isoforms. The HEK-293 cells exhibit down-regulation of Akt phosphorylation on Ser473 and subsequent attenuation of cell growth rate, as well as inhibition of cell motility.

Мета. Створити клітини HEK293 з порушеною експресією S6K1 ізоформ: p85, p70 і Р60. Методи. CRISPR/cas9 система редагування генома, Вестерн-блот, імунофлуоресцентний аналіз, ПЛР-аналіз, MTT тест, метод «раневої поверхні». Результати. Отримано декілька клонів клітин НЕК-293 з повною втратою експресії білка p85/p70/p60-S6K1. Було оцінено ефект нокауту p85/p70/p60-S6K1 на Akt/mTORC1/S6K1 сигналінг та клітинні проліферацію і міграцію. Висновки. Створені клітинні лінії можуть бути використані для вивчення ролі, яку відіграє S6K1 в фізіології клітини, що дозволяє отримати більш детальне уявлення про клітинні функції ізоформ S6K1. Клітини / / HEK-293 виявляють знижений рівень фосфорилювання Akt по Сер473 і подальше пригнічення швидкості клітинного росту разом з інгібуванням клітинної рухливості.

Цель. Создать клетки HEK293 с нарушенной экспрессией S6K1 изоформ: p85, p70 и Р60. Методы. CRISPR/cas9 система редактирования генома, Вестерн-блот, иммунофлуоресцентный анализ, ПЦР-анализ, MTT тест, метод «раневой поверхности». Результаты. Получено несколько клонов клеток НЕК-293 с полной потерей экспрессии белка p85/p70/p60-S6K1. Была проведена оценка влияния нокаута p85/p70/p60-S6K1 на Akt/mTORC1/S6K1 сигналинг и клеточные пролиферацию и миграцию. Выводы. Созданные клеточные линии могут быть использованы для изучения роли, которую играет S6K1 в физиологии клетки и позволить получить более детальное представление о клеточных функциях изоформ S6K1. Клетки / / HEK-293 показывают пониженный уровень фосфорилирования Akt по Сер473 и дальнейшее угнетение скорости клеточного роста вместе с ингибированием клеточной подвижности.