Differentiation of pluripotent stem cells into cardyomyocytes is influenced by size of embryoid bodies

Abstract

Aim. To find the relationship between the size of embryoid bodies and the efficiency of pluripotent stem cells differentiation into cardiomyocytes. Methods. Transgenic murine iPSC line AT25 and D3 ESC line αPIG (clone 44) were differentiated into cardiomyocytes in AggreWell plates containing microwells which cause the pluripotent stem cells to aggregate into EBs of an appropriate size. Both cell lines were genetically modified and expressed IRES-flanked enhanced green fluorescent protein (eGFP) under the control of cardiac alpha myosin heavy chain promoter. We applied flow cytometry and fluorescence microscopy to test the efficiency of the differentiation processes. Results. The efficiency of differentiation of embryoid bodies formed from iPSC line AT25 and containing 250 and 1000 cells was found to be lower as compared to embryoid bodies formed of 500 and 750 cells. The number of eGFP+ cells derived from embryoid bodies of 500 cells was 8.5 times higher compared to embryoid bodies of 250 cells (2.86 ± 0.30 % cardiomyocytes per embryoid bodies of 500 cells vs. only 0.34 % cardiomyocytes per embryoid bodies containing 250 cells); the difference was 4.7 times higher in comparison with embryoid bodies formed from 1000 cells. Conclusions. The size of embryoid bodies can affect differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes. Among the embryoid bodies formed from 250 to 2000 cells per embryoid body, the highest percentage of eGFP+ cells was obtained from 500-cell embryoid bodies.

Мета. Знайти зв’язок між розміром ембріоїдних тілець та ефективністю диференціювання плюрипотентних стовбурових клітин в кардіоміоцити. Методи. Трансгенні клітинні лінії індукованих плюрипотентних клітин AT25 та ембріональних стовбурових клітин D3 αPIG44 диференціювали в кардіоміоцити в AggreWell планшетах. Вище згадані планшети містять мікролунки, які дають можливість сформувати ембріоїдні тільця з плюрипотентних стовбурових клітини певного заданого розміру. Обидві клітинні лінії були генетично модифіковані і експресували IRES-фланкований зелений флуоресцентний білок (еGFP), під контролем кардіоспецифічного α-MHC промоутера. Для перевірки ефективність процесів диференціювання було застосовано методи проточної цитометрії та флуоресцентної мікроскопії. Результати. Встановлено, що ефективність диференціювання ембріоїдних тілець отриманих з лінії індукованих плюрипотентних клітин лінії AT25 розміром 250 і 1000 клітин менша в порівнянні з ембріональними тільцями сформованими з 500 і 750 клітин. Кількість eGFP+ клітин, отриманих з ембріоїдних тілець розміром 500 клітин була 8,5 разів більшою ніж з ембріональних тілець розміром 250 клітин (що становило 2,86 ± 0,30 % кардіоміоцитів для ембріоїдних тілець розміром 500 клітин, і лише 0,34 % eGFP+ клітин для ембріоїдних тілець розміром 250 клітин). Висновки. Впливати на ефективність диференціювання плюрипотентних стовбурових клітин в кардіоміоцити можна змінюючи початковий розмір ембріоїдних тілець. Серед ембріоїдних тілець, утворених в діапазоні від 250 до 2000 клітин, найвищий відсоток eGFP + клітин отримували з ембріоїдних тілець, утворених 500 клітинами.

Цель. Найти связь между размером эмбриоидных телец и эффективностью дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты. Методы. Трансгенные клеточные линии индуцированных плюрипотентных клеток AT25 и эмбриональных стволовых клеток D3 αPIG44 дифференцировали в кардиомиоциты в AggreWell планшетах. Упомянутые планшеты содержат микролунки, дающие возможность сформировать эмбриоидные тельца из плюрипотентных стволовых клеток определенного заданного размера. Обе клеточные линии были генетически модифицированы и экспрессировали IRES-фланкированый зеленый флуоресцентный белок (еGFP), под контролем кардиоспецифического α-MHC промотера. Для проверки эффективности процессов дифференцировки были применены методы проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Результаты. Было установлено, что эффективность дифференцировки эмбриоидных телец полученных из линии индуцированных плюрипотентных клеток AT25 размером 250 и 1000 клеток меньше по сравнению с эмбриональными тельцами сформированными из 500 и 750 клеток. Количество eGFP + клеток, полученных из эмбриоидных телец размером 500 клеток была 8,5 раз больше чем по сравнению с эмбриональными тельцами размером 250 клеток (что составляло 2,86 ± 0,30 % кардиомиоцитов для эмбриоидных телец размером 500 клеток, и только 0,34 % eGFP+ клеток для эмбриоидных телец размером 250 клеток). Выводы. Изменение первоначального размера эмбриоидных телец влияет на эффективность дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты. Среди эмбриоидных телец, образованных в диапазоне от 250 до 2000 клеток, высокий процент eGFP + клеток получали из эмбриоидных телец, образованных 500 клетками.