Detection of stress resistance genes in transgenic maize by multiplex and touchdown polymerase chain reaction

Abstract

Aim. To develop a methodology for detection of the genes of resistance to the stress factors in transgenic maize by multiplex (mPCR) and touchdown polymerase chain reactions. Methods. isolation of total DNA by CTAB method, purification of DNA from RNA and proteins, electrophoresis of total DNA and amplification products in agarose gel, polymerase chain reaction. Results. The protocol of multiplex and touchdown polymerase chain reactions has been developed for simultaneous verification of the quality of total DNA extracted from the studied maize plant samples and detection of the following genes that determine resistance to the stress factors in the transgenic maize and maize transformation events: BT176, MON810, MON88017, DAS1507, DAS59122, MIR604, GA21, NK603 (mPCR), Bt11, MON863, MON89034, T25 (touchdown PCR). The multiplex PCR and touchdown PCR were developed using the reference samples. Conclusions. The proposed protocol of mPCR and touchdown PCR reactions can be used for mass analysis of maize samples to detect the genes of tolerance/resistance to herbicides and genes of resistance to insects reliably, authentically, quickly and cheaply.

Мета. Розробити методику детекції генів стійкості до стресових факторів у трансгенної кукурудзи на основі мультиплексної (мПЛР) та низхідної (touchdown PCR) полімеразних ланцюгових реакцій. Методи. Виділення загальної ДНК ЦТАБ методом, очистка ДНК від білків та РНК, електрофорез загальної ДНК та продуктів ампліфікації в агарозному гелі, полімеразна ланцюгова реакція. Результати. Розроблено методики мПЛР та низхідної ПЛР, котрі дозволяють одночасно перевіряти якість загальної ДНК, яку виділили з досліджуваних рослинних зразків кукурудзи, та детектувати гени стійкості до стресових факторів, що входять до складу трансформаційних подій кукурудзи BT176, MON810, MON88017, DAS1507, DAS59122, MIR604, GA21, NK603 (мПЛР) та Bt11, MON863, MON89034, T25 (низхідна ПЛР). мПЦР та низхідна ПЦР розроблені з використанням референтних зразків. Висновки. Методика може бути використана для масового аналізу зразків кукурудзи. За допомогою мультиплексної та низхідної ПЛР можна надійно, достовірно, швидко та досить дешево виявляти гени толерантності/стійкості до гербіцидів і гени стійкості до комах шкідників.

Цель. Разработать методику детекции генов устойчивости к стрессовым факторам у трансгенной кукурузы на основе мультиплексной (мПЦР) и нисходящей (touchdown PCR) полимеразных цепных реакций. Методы. Выделение общей ДНК ЦТАБ методом, очистка ДНК от белков и РНК, электрофорез общей ДНК и продуктов амплификации в агарозном геле, полимеразная цепная реакция. Результаты. Разработаны методики мПЦР и нисходящей ПЦР, позволяющие одновременно проверять качество общей ДНК, выделенной из исследуемых растительных образцов кукурузы, и детектировать гены устойчивости к стрессовым факторам, входящие в состав трансформационных событий кукурузы BT176, MON810, MON88017, DAS1507, DAS59122, MIR604, GA21, NK603 (мПЦР) и Bt11, MON863, MON89034, T25 (нисходящая ПЦР). мПЦР и нисходящая ПЦР разработаны с использованием референтных образцов. Выводы. Методика применима для массового анализа образцов кукурузы. С помощью мультиплексной и нисходящей ПЦР можно надежно, достоверно, быстро и достаточно дешево выявлять гены толерантности/устойчивости к гербицидам и гены устойчивости к насекомым вредителям.