Effects of Transduction of the bcl-2 Gene and of Nerve Growth Factor on Apoptosis of Cultured PC12 Cells

Abstract

We examined what effects are exerted by expression of the bcl-2 gene and by treatment with nerve growth factor (NGF) on the intensity of apoptosis in cultured pheochromocytoma cells (PC12 cells). Half of these cells were transduced with the bcl-2 gene using lentiviral plasmids, and the respective two groups were denoted as bcl-2-PC12 and control (c) PC12. Then the cells were incubated in a serum-free medium in six different modes. One group of c-PC12 cells was incubated in this medium with no additional agents added, another group was incubated with 1.0 mM H₂O₂ , and the third group was incubated with both 1 mM H₂O₂ and 20 ng/ml NGF (groups 1-3). Cells of the another triad were incubated under the same conditions, respectively, but these were bcl-2-PC12 cells (groups 4-6). The apoptosis rate in each group after 1-h-long incubation was measured using a flow cytometry method. A bicinchoninic acid (BCA) technique was used for estimation of expression of Bcl-2 protein in the cultures. As was observed, the action of H₂O₂ significantly increased the apoptosis rate in both c-PC12 and bcl-2-PC12 samplings, while simultaneous action of NGF considerably attenuated such increases. At the same time, values of the apoptosis rate for bcl-2-PC12 cells were much smaller than the respective values for c-PC12 cells under all the three modes of incubation. In H₂O₂ -treated cultures, the amount of Bcl-2 protein dropped, while the treatment with NGF counteracted such shifts. The content of this protein in the bcl-2-PC12 groups was much higher than in the c-PC12 groups. Thus, transduction with the bcl-2 gene significantly inhibits apoptosis in cultured PC12 cells, and a combined influence of expression of this gene and treatment with NGF produces a synergistic effect.

Ми досліджували впливи експресії гена bcl-2 та дії нервового фактора росту (NGF) на інтенсивність апоптозу культивованих клітин феохромоцитоми (PC12). У половину таких клітин був трансдукований ген bcl-2; відповідні дві групи зразків були позначені як bcl-2-PC12 та контрольні (с-PC12). Потім шість груп клітин інкубували в безсироватковому середовищі в різних умовах. Перша група клітин с-PC12 інкубувалася без дії будь-яких додаткових агентів, друга група – з додаванням 1 мМ H₂O₂

, а третя – в присутності як 1 мМ H₂O₂

, так і 20 нг/мл NGF. Клітини трьох інших груп (4–6) інкубували в тих самих умовах, але це були клітини bcl-2-PC12. Ступінь апоптозу в кожній групі після одногодинної інкубації вимірювали з використанням методу флоуцитометрії. Методику з використанням біцинхонінової кислоти застосовували для оцінки експресії білка Bcl-2 в культурах. Як було виявлено, дія H₂O₂ істотно збільшувала ступінь апоптозу в зразках як c-PC12, так і bcl-2-PC12, але одночасна дія NGF помітно зменшувала таке зростання. В той же час інтенсивності апоптозу клітин bcl-2-PC12 були значно меншими, ніж відповідні значення у клітин c-PC12 при всіх трьох режимах інкубації. В культурах, підданих впливу H₂O₂

, кількість протеїну Bcl-2 була зменшеною, тоді як вплив NGF протидіяв таким зрушенням. Вміст згаданого протеїну в групах bcl-2-PC12 був значно вищим, ніж у групах c-PC12. Отже, трансдукція гена bcl2 істотно гальмує апоптоз культивованих клітин PC12, а комбінований вплив експресії цього гена та аплікації NGF забезпечує сінергічні ефекти.