Analysis of growth kinetics and proliferative heterogeneity of Lewis lung carcinoma cells growing as unfed culture

Abstract

Аim: To analyze the growth kinetics and proliferative heterogeneity of Lewis lung carcinoma (LLC) cells during their growth in monolayer for 5 days without replacement of culture medium (unfed culture). Methods: Cell biology methods, sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for vascular endothelial growth factor (VEGF) detection (ELISA), enzymatic glucose-oxidase method for glucose measurements, mathematical modeling. Results: Created mathematical model showed good fit to experimental data; that allowed to determine kinetic (model) parameters of LLC cells and predict the changes in number of proliferating and quiescent cells (proliferative heterogeneity) during their growth. It was shown that growth kinetics of viable LLC cells possesses non-monotonous character — during first three days of growth the number of cells raised exponentially, with following decrease after the maximal level was achieved. At the same time the decrease of number of viable cells/increase of number of dead cells has been observed upon complete depletion of culture medium by glucose content. Glucose dependence of cell transition rate from proliferation to resting state predicted by mathematical model possessed a pronounced two-phase character. At a wide range of relatively high glucose concentrations (> 1.0 mg/ml) the transition rate was close to zero. At concentrations lower than 0.7 mg/ml, the rate of transition swiftly increased resulting in sharp change in cellular composition. At an interval from 70 to 90 h, practically all proliferating cells transited to a resting state. The rate of quiescent cell death was relatively low, and this was in part caused by too low level of glucose consumption compared to proliferating cells. It was shown that during LLC cells growth VEGF production rate decreased monotonously in spite of the fact that the level of VEGF in incubation medium increased monotonously. Observed monotonous decrease of VEGF production rate could not be explained by VEGF degradation in incubation medium (our results displayed the stability of VEGF molecule during investigations). Conclusions: Weak dependence of cell transition rate from proliferating to resting state from glucose level (> 0.7 mg/ml) and low rate of cell death provided slow decrease of the pool of quiescent cells in the population, thus significantly increasing their chance to survive upon nutritional deficiency.

Цель: провести анализ кинетики роста и пролиферативной гетерогенности клеток карциномы легкого Льюис (LLC) при их росте в монослое на протяжении 5 сут без замены культуральной среды (unfed culture). Методы: иммуноферментный метод определения уровня продукции VEGF опухолевыми клетками; глюкозооксидазный метод определения уровня глюкозы в среде инкубации; математическое моделирование. Результаты: предложенная математическая модель хорошо описывает экспериментальные данные, что позволяет определить кинетические параметры роста клеток LLC и предсказать изменения количества пролиферирующих и покоящихся клеток (пролиферативная гетерогенность) в процессе их роста. Кинетика роста клеток LLC носит немонотонный характер — в течение первых 3 сут их роста количество клеток экспоненциально увеличивается и далее, по достижении максимальной плотности, снижается. В то же время уменьшение количества живых клеток/увеличение количества мертвых клеток тесно связано с истощением глюкозы в среде инкубации. Зависимость скорости перехода клеток из состояния пролиферации в состояние покоя от содержания глюкозы в среде инкубации имеет выраженный двухфазный характер. В широком диапазоне относительно высоких концентраций глюкозы (> 1,0 мг/ мл) скорость перехода близка к нулю. При концентрациях < 0,7 мг/мл скорость перехода стремительно возрастает, что приводит к резким изменениям клеточного состава клеточной популяции. В интервале от 70 до 90 ч практически все пролиферирующие клетки переходят в состояние покоя. Скорость гибели покоящихся клеток относительно низкая, что, в частности, связано с низким уровнем потребления глюкозы этими клетками по сравнению с таковым пролиферирующими клетками. Установлено, что в процессе роста скорость продукции VEGF клетками LLC монотонно снижается, несмотря на то, что в среде инкубации его уровень монотонно нарастает. Выводы: низкая зависимость скорости перехода клеток LLC из состояния пролиферации в состояние покоя от уровня глюкозы (> 0,7 мг/мл) в среде инкубации, а также низкий уровень их гибели обусловливает медленное снижение пула покоящихся клеток в популяции, что значительно повышает их шансы выжить в условиях дефицита питательных субстратов.