Involvement of human beta-defensin-2 in intracellular signaling: in vitro study

Abstract

Aim: To analyze involvement of human beta-defensin-2 (hBD-2) in intracellular signaling in vitro. Materials and Methods: A431cells were cultured in the presence of 1 µg/ml of recombinant hBD-2 and/or 10 ng/ml EGF. For evaluation of expression of mRNAs for p70S6 kinase, isoforms alpha and beta, RT-PCR analysis was applied. Expression and activity of p70S6K, phosphorylation of PDK1, ERK, JNK, p38 kinases and EGF receptor (EGFR) was evaluated using Western blot analysis. Results: 30 min incubation of A431 cells with 1 µg/ml of hBD-2 didn’t influence autophosphorylation level of EGFR, but resulted in activation of p70S6K, 12 h treatment – in prominently increased level of mRNA for alpha and beta-isoforms of p70S6 kinase, whilst 24 h treatment – in elevation of p70S6K synthesis on protein level. Up-stream kinase phosphorylating p70S6K, PDK1, is also phosporylated upon influence of exogenous hBD-2 in vitro. Conclusion: Our data point on the involvement of PDK1-p70S6K pathway in mediation of action of hBD-2 in A431 cells.

Цель: проанализировать участие бета-дефенсина-2 человека (hBD-2) в механизмах передачи внутриклеточных сигналов в модели in vitro. Материалы и методы: клетки линии A431 культивировали в присутствии 1 µг/мл рекомбинантного hBD-2 и/или 10 нг/мл ЭФР. Экспрессию мРНК альфа- и бета-изоформ p70S6 киназы оценивали методом полуколичественного ОТ-ПЦР анализа. Экспрессию и активность p70S6K, фосфорилирование PDK1, ERK, JNK, p38 киназ и рецептора ЭФР (ЭФРР) исследовали методом Вестерн-блот анализа. Результаты: 30 мин инкубация клеток A431 с 1 µг/мл hBD-2 не оказывала влияния на уровень аутофосфорилирования ЭФРР, но препятствовала образованию димеров рецептора в присутствии ЭФР. В то же время 30 мин обработка клеток hBD-2 приводила к активации p70S6K, 12 ч — к значительному повышению уровня мРНК альфа- и бета-изоформ p70S6 киназы, а 24 ч — к повышению синтеза p70S6K на уровне белка. PDK1-киназа, фосфорилирующая p70S6K, также подвергалась фосфорилированию в присутствии экзогенного hBD-2 in vitro. Выводы: данные свидетельствуют об участии каскада PDK1-p70S6K в опосредовании действия hBD-2 в клетках A431.