Влияние условий удаления криопротектора ДМСО на жизнеспособность и колониеобразующую активность криоконсервированных клеток эмбриональной печени человека

Abstract

Изучено влияние различных условий удаления криопротектора ДМСО на жизнеспособность (ЖС) и колониеобразующую активность свежевыделенных и криоконсервированных клеток эмбриональной печени (КЭП) человека 7-10 недель гестации. Использование раствора Хенкса как среды отмывания (СО) приводит к снижению общего количества и количества жизнеспособных КЭП. Замена NaCl на сахарозу снижает повреждающее действие процедуры отмывания криопротектора. При этом медленное введение сахарозо-солевого раствора (ССР) позволяет в большей степени сохранить ЖС клеток по сравнению с быстрым способом добавления. Оценку повреждающего действия этапа удаления ДМСО проводили 2 методами окрашивания (трипановым синим и бромистым этидием), учитывая общее количество клеток, ЖС и выход жизнеспособных клеток (ВЖК). Результаты, полученные при различных условиях удаления криопротектора, не зависели от метода оценки и показали, что ВЖК является наиболее чувствительным параметром жизнеспособности криоконсервированных клеток. Колониеобразующая активность КЭП человека при культивировании в агаре на фидерном слое, содержащем лейкоциты здоровых взрослых доноров, после криоконсервирования и медленного удаления ДМСО с помощью ССР оставалась на уровне нативного контроля. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ССР меньше повреждает КЭП человека на этапе удаления криопротектора ДМСО.

Вивчено вплив різних умов видалення кріопротектора ДМСО на життєздатність і колонієутворюючу активність нативних і кріоконсервованих клітин ембріональної печінки (КЕП) людини 7-10 тижнів гестації. Використання розчину Хенкса як середовища відмивання приводить до зниження загальної кількості і кількості життєздатних КЕП. Заміна NaCl на сахарозу знижує негативний вплив процедури видалення кріопротектора. При цьому повільне введення сахарозо-сольового розчину (ССР) дозволяє більше зберегти життєздатність клітин у порівнянні зі швидким способом відмивання. Оцінку дії етапу видалення ДМСО проводили 2 методами фарбування (трипановим синім і бромистим етидієм), враховуючи загальну кількість клітин, життєздатність і вихід життєздатних клітин. Результати, отримані при різних умовах видалення кріопротектора, не залежали від методу оцінки і показали, що вихід життєздатних клітин є найбільш чуттєвим параметром життєздатності кріоконсервованих клітин. Колонієутворююча активність КЕП людини при культивуванні в агарі на фідері, що містить лейкоцити здорових дорослих донорів, після кріоконсервування і повільного видалення ДМСО за допомогою ССР залишалася на рівні нативного контроля. Отримані результати свідчать про те, що ССР найменше ушкоджує КЕП людини на етапі видалення кріопротектора ДМСО.

The authors studied the influence of various conditions of Me₂SO cryoprotectant removal on viability and colony forming activity of freshly isolated and cryopreserved cells of human fetal liver (HFL) of 7-10 gestation weeks. Usage of Hanks solution as a washing-out medium (WM) leads to a decrease in both total number of HFL cells and their viability. Substitution of NaCl with sucrose decreases the damaging effect of cryoprotectant washing-out procedure. In this case a slow introduction of sucrose based saline (SBS) allows to preserve the cells’ viability when comparing with rapid washing-out. Estimation of damaging effect of Me₂SO removal stage was performed by two staining methods (trypan blue and ethidium bromide) with determining the total cell number, viability and cell survival. The results, obtained under various cryoprotectant removal conditions, did not depend on estimation method and showed that cell survival was the most sensible parameter for viability of cryopreserved cells. The value of colony forming activity of HFL cells by culturing in agar on feeder layer with leukocytes of healthy adult donors after cryopreservation and slow removing of Me₂SO with SBS was at the control level. Obtained results testify to the fact that SBS does less damages to HFL cells at the stage of Me₂SO cryoprotectant removal.