Изучение влияния lox-сайтов Cre-lox системы рекомбинации на экспрессию беспромоторного bar гена в трансгенных растениях

Abstract

Показано, что при размещении lox-сайта в генетических конструкциях в непосредственной близости от правой границы Т-ДНК (RB – lox – bar –) происходит стабильная экспрессия следующего за lox-сайтом беспромоторного bar гена. Генетические конструкции, которые были использованы в работе, содержали также ген неомицинфосфотрансферазы II (npt II) под контролем nos промотора. Трансформированные растения Nicotiana tabacum и N. africana были отобраны по способности расти на среде, содержащей канамицин, а затем протестированы на селективной среде, содержащей фосфинотрицин. У 80 % трансгенных растений, отобранных по устойчивости к канамицину, экспрессия bar гена происходила на таком же уровне, как и у растений, трансформированных конструкциями, в которых bar ген находится под сильным конститутивным промотором. При использовании конструкции без lox-сайта, в которой беспромоторный bar ген находится возле правой границы Т-ДНК (RB – bar –), либо конструкций, в которых lox-сайт и беспромоторный bar ген расположены в середине конструкции (– lox – bar –), частота РРТ-устойчивых растений составила не более 4,5 %. Анализ с помощью ПЦР не выявил возможных тандемных повторов или рекомбинации, в результате которых беспромоторный bar ген мог оказаться под контролем промотора, находящегося в плазмиде. При встраивании nos-терминатора в вектор между lox-сайтом и правым бордером частота РРТ-устойчивых трансгенных растений не изменилась.

We demonstrate that localization of lox site between the right border of T-DNA and promoterless bar gene (RB - lox - bar -) led to its highly efficient expression in transgenic plants of Nicotiana tabacum and N. africana.. Plasmid vectors used in gene integration experiments contained neomycin phosphotransferase II (npt II) gene under nos promoter as well. Transgenic plants were selected according to their capacity to grow on the medium with kanamycin and then they were tested on the selective medium containing phosphinothricin. 80 % of transgenic plants expressed bar gene at the level similar to that in plants transformed with the bar gene under widely used constitutive promoter. Transformation of plants with the plasmid vector containing only promoterless bar gene near T-DNA right border (RB– bar -) and with the vector containing lox site and promoterless bar gene in the middle of the construction (-lox-bar-) led to obtaining no more than 4,5 % of transgenic plants resistant to phosphinothricin. PCR analyses confirmed both the absence of tandem repeats and of plasmid recombination resulting in transference of bar gene under promoter in plasmid vector.. Nos-terminator situated between the lox site and the right border of T-DNA did not decrease bar gene expression.