Флюоресцентный зонд AEDANS ковалентно присоединяли к тирозил-тРНК синтетазе из печени быка (КФ 6.1.1.1). Стехиометрия связывания составляет около двух молекул зонда на димер фермента. Для измерения расстояний между шестью триптофановыми остатками синтетазы (донор) и ковалентно присоединенным AEDANS (акцептор) использовали синглет-синглетный перенос энергии по Ферстеровскому механизму. В свободном ферменте усредненное расстояние донор – акцептор составляет 2,74 нм. Взаимодействие гомологичной тРНКTyr с тирозил-тРНК синтетазой из печени быка приводило к увеличению флюоресценции AEDANS-меченного фермента (25 %). После связывания с гомологичной тРНКТуr среднее расстояние между триптофановыми остатками и зондом AEDANS уменьшилось до 2,53 нм. Гетеро логичная тРНКTyr из Е. coli не индуцировала таких изменений. Добавление ATP к комплексу синтетазы с гомологичной тРНКTyr вызывает дальнейшее увеличение флюоресценции AEDANS (32 %) и сокращение расстояния донор–акцептор до 2,41 нм. Эти результаты свидетельствуют о конформационном изменении эукариотической тирозил-тРНК синтетазы при взаимодействии с гомологичной тРHKTyr
Флюоресцентный зонд AEDANS ковалентно приєднували до тирозил- тРНК синтетази із печінки бика (КФ 6.1.1.1). Стехіометрія зв'язування складає біля двох молекул зонда на димеїр ферменту. Для вимірювання відстаней між шістьма триптофановими залишками синтетази (донор) та ковалентно приєднаним AEDANS (акцептор) використовували синглет-синглетний перенос енергії за Ферстеровським механізмом. У вільному ферменті середня відстань донор–акцептор складає 2,74 нм. Взаємодія гомологічної тРНКTyr з тирозил-тРНК синтетазою з печінки бика призводила до збільшення флюоресценції AEDANS-міченого ферменту (25%). Після зв'язування з гомологічною тРНКTyr середня відстань між триптофановими залишками і зондом AEDANS зменшилася до 2,53 нм. Гетерологічна тРНКTyr із Е. соlі не індукувала таких змін. Додавання ATP до комплексу синтетази з голомогічною тРНКTyr викликає подальше збільшення флюоресценції AEDANS (32 %) та скорочення відстані донор– акцептор до 2,41 нм. Ці результати свідчать про конформаційні зміни іеукаріотичної тирозил-тРНК синтетази при взаємодії з гомологічною тРНКTyr .
The fluorescent probe 1,5-1-AEDANS was covalently attached to tyrosyl-tRNA synthetase from bovine liver in a nearly stoichiometric amount (2 molecules of probe per enzyme dimer). Singlet-singlet energy transfer has been used for measurement of the apparent distance, between 6 tryptophan residues of enzyme and covalently attached 1,5-1-AEDANS. This distance was about 27.4 A assuming the random orientation of the donor and acceptor from polarization measurements. The interaction of cognate. tRNATyr with bovine tyrosyl-tRNA synthetase also resulted in the enhancement of fluorescence of AEDANS-labelled tyrosyRRNA synthetase (25 %) due to the increase of energy transfer efficiency. After binding of cognate bovine tRNATyr the apparent distance between tryptophan residues and AEDANS probe reduced to 25.3 A E. coli tRNATyr which was not aminoacylated by bovine enzyme did not induced these effects. Adding of ATP to the complex of bovine tRNATyr and tyrosyl-tRNA synthetase exhibited further enhancement of AEDANS fluorescence by 32 %. In this case the apparent distance between tryptophan residues and AEDANS probe was 24.1 A. These results are consistent with the conformational change of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase, in the course of recognition of cognate tRNATyr.
