Выделение гистидиновой тРНК из Thermus thermophilus и изучение ее первичной структуры и участков взаимодействия с гомологичной аминоацил-тРНК синтетазой

Abstract

Структура гистидиновых тРНК (тPHКʰᶦˢ) отличается от структур тРНК других аминокис­ лотных специфичностей наличием на 5'-конце дополнительного нуклеотида (G-J). Для изучения молекулярного механизма взаимодействия тPHКʰᶦˢ с гистидил-тРНК синтетзой разработан метод очистки тPHКʰᶦˢ из Т. thermophilus и изучена первичная структура изоакиепторной формы тPHКʰᶦˢ1. Индивидуальную тРНК выделяли из суммарной тРНК, используя комбинацию хроматографии низкого давления на бензоилированной ДЭАЭ-целлюлозе (БД-целлюлоза) и ДЭАЭ Toyopearl 650 с жидкостной хроматографией высокого давления на колонках DEAE 5PW и Ultrapore С8. Первичную структуру тPHКʰᶦˢ1 из Т. thermophilus определяли с использованием методов быстрого гель-секвенирования. Изученная структура отличается от тPHКʰᶦˢ из Escherichia coli по 23 положениям. Участки взаимодействия тPHКʰᶦˢ из 1Т. thermophilus с гистидил-тРНК синтетазой исследовали с помощью метода химической модификации нитрозоэтилмочевиной. Показано, что гистидил-тРНК синтетаза защищает от алкилирования этилнитрозомочевиной следующие фосфаты тPHКʰᶦˢ 8 — между акцепторным и D-стеблем; 27, 28, 29 — с 5'-стороны антикодонового стебля; фосфат 34 в антикодрне и фосфаты 67, 68 с 3'-стороны акцепторного стебля. Все обнаруженные участки тPHКʰᶦˢ локализованы на одной стороне пространственной структуры тРНК — там же, где и вариабельный стебель. D-стебель находит­ся с противоположной стороны и не взаимодействует с ферментом.

Histidine tRNAs (tRNAʰᶦˢ) are unique in possing an extra 5?-base (G-1) not found in other tRNAs. To study the molecular mechanisms of tRNAʰᶦˢ interaction with histidyl-tRNA synthetase, the method for purification of tRNAʰᶦˢ from Thermus thermophilus has been developed and tRNA1ʰᶦˢ has been sequenced. tRNAʰᶦˢ from Thermus thermophilus was isolated by combination of low-pressure benzoyl-DEAE- cellulose and DEAE Toyopearl 650 chromatographies with HPLC on DEAE 5PW and reversed phase columns. The nucleotide sequence of T. thermophilus tRNA1ʰᶦˢ has been determined by rapid gel-sequencing method. tRNA1ʰᶦˢ from T. thermophilus is different from those of E.coli at 23 positions. The sites of interaction of tRNAʰᶦˢ with histidyl-tRNA synthetase have been studied by the method of chemical modification with ethylnitrosourea. histidyl-tRNA synthetase protects from modification following phospates: 8 – between acceptor and D-stems, 27, 28, 29 from 5?-end of anticodon stem, 34 – at the anticodon and phosphates 67, 68 from 3?-end of acceptor stem. All the protected sites of tRNAhis are found on one side of three-dimensional structure of tRNA where the variable stem is also located. D-stem is located on the opposite side and does not interact with the enzyme.

Структура гістидинових тРНК тPHКʰᶦˢ відріняється від структур тРНК інших амінокислотних специфічностей наявністю на 5'-кінці додаткового нуклеотиду (G-1)- Для вив­чення молекулярних механізмів взаємодії тРНК з гістидил-тРНК синтетазою розроблено метод очищення тPHКʰᶦˢ з Т. thermophilus і вивчено первинну структуру ізоакцепторної форми mPHKʰᶦˢ₁ . індивідуальну тРНК ʰᶦˢвиділяли із сумарної тРНКʰᶦˢ, використовуючи поєднання хроматографії низького тиску на бензоїлованій ДЕАЕ-целюлозі (БД-целюлоза) і ДЕАЕ Toyopearl 650 з рідинною хроматографією високого тиску на колонку DEAE 5PW і Ultrapore С8. Первинну структуру тPHКʰᶦˢ₁ із Т. thermophilus визначено з використанням мето­ду швидкого гель-секвенування. Вивчена первинна структура відрізняється від тРНк₁8 із Escherichia coli за 23 положення­ми. Ділянки взаємодії тPHКʰᶦˢ₁з Т. thermophilus із гістидил-тРНК синтетазою досліджували методом хімічної модифі­кації нітрозоетилсечовиною. Показано, що гістидил-тРНК синтетаза захищає від алкілування нітрозоетилсечовиною такі фосфати тРНК : 8 — між акцепторную і D-гілкою; 27, 28, 29 — 3 боку 5'-кінця антикодонової гілки; фосфат 34 — в антикодоні і фосфати 67, 68 — з боку 3'-кінця акцепторное гілки. Усі виявлені ділянки тРНк локалізуються на одному боці просторової структури тРНК — там, де й варіабельна гілка. D-гілка розташована з протилежного боку і не взаємодіє з ферментом